ELISA抗体验证：确保实验结果准确性

  抗体是生命科学研究较为广泛工具之一，抗体目前面临一个问题——交叉反应。ELISA可以定量多种样品基质（包括生物样品）中的蛋白质，这些样品可能需要经过一些预处理步骤，例如稀释、裂解或纯化，以去除干扰物质并优化检测。ELISA的成功在很大程度上取决于所用抗体对的特异性和亲和力。因此，验证抗体是确保ELISA实验准确且可重复关键步骤。

  抗体验证

  抗体验证至关重要，如下原因：

  1.特异性：确保抗体仅与目标抗原结合而不与其他蛋白质结合。

  2.灵敏度：甚至可以检测到低浓度的抗原。

  3.可重复性：在不同的实验和实验室中获得一致的结果。

  4.准确度：正确量化目标抗原。

  在之前的文章《抗体选择：如何区分好抗体和坏抗体》提到抗体验证的五大支柱有望提高可重复性，分别是遗传策略、正交策略、独立抗体策略和标记蛋白的表达等。

  检测特异性抗体验证

  值得注意的是，针对各种抗体检测，样品的制备方式不同。对于流式细胞术和ELISA，蛋白质通常为天然形式，而对于蛋白质印迹、免疫组织化学和免疫细胞化学，蛋白质则部分或完全变性。由于蛋白质构象和靶标可及性不同，在一种检测中效果良好的抗体可能在另一种检测中表现不佳。这种复杂性使得很难建立一个单一的基准来评估所有可能应用中的抗体性能。因此，抗体验证方法必须根据具体应用和情况进行量身定制。

  夹心ELISA抗体验证

  ELISA实验检测可溶性物质，如肽、蛋白质、抗体和激素。它们通常以“夹心”形式进行（图）。夹心ELISA通过使用结合到ELISA板上的捕获抗体来固定目标蛋白质，同时检测抗体产生读出信号来识别分析物。与间接形式相比，使用抗体对可显著提高夹心ELISA的特异性和灵敏度，而抗体验证是确保准确和可重复结果的关键步骤。

  寻找并验证ELISA抗体对

  1.了解目标蛋白

  a.蛋白质结构：抗体对与抗原表面的互补表位结合。必须了解靶蛋白的天然确认，以探索单个表位作为抗体靶标的适用性。

  b.生物相关性：考虑您正在研究的生物环境中目标蛋白质的作用和表达。

  c.翻译后修饰(PTM)、异构体和裂解产物：注意任何可能影响抗体结合的修饰。

  2.包括适当的控制

  a.表达确认：确保目标蛋白质在所选样本中表达。

  b.对照：使用阳性和阴性对照来验证抗体特异性。

  3.抗体验证

  确保公司验证数据是在与您要求的相同样品类型中进行的，因为基质效应可能会干扰抗体结合。您可以使用加标和回收率以及稀释线性来测试样品类型中抗体对的适用性。

  如果需要，请按照抗体验证的五大支柱进行进一步验证。

  4.确定最佳抗体浓度

  进行棋盘滴定以确定捕获和检测抗体的最佳浓度。

  ELISA检测验证

  为了验证用于测量生物流体中分析物浓度的ELISA方法，根据Andreasson等人在论文“免疫测定方法验证实用指南”中描述的指导原则，建议执行以下步骤：

  精度：重复测量的接近程度的度量

  1.运行内精度：在一次运行中分析至少两个样品（一个高浓度，一个低浓度）的多个重复样品。

  2.运行间精度：分析不同运行和日期内同一样品的多次重复实验。

  灵敏度：通过分析已知低浓度的样品确定定量限(LOQ)。LOQ是可以以可接受的精度和准确度可靠地定量分析物的最低浓度。

  基质效应是指基质中存在的物质产生的干扰。可以通过稀释样品来减少基质效应。可以通过在样品中加入目标分析物并分析回收率来检查基质效应。

  蛋白质稳定性：评估样品中分析物在不同储存条件下（例如室温、4°C、-20°C）以及多次冻融循环后的稳定性。这对于避免与样品采集和储存相关的系统误差非常重要。

  交叉反应测试：测试抗体与一组相关蛋白质的交叉反应。此步骤可确保抗体对目标抗原具有特异性，并且不会与其他蛋白质上的类似表位结合。Blast®等工具在此过程中非常有用。

  ELISA故障排除

  尽管经过严格验证，ELISA过程中仍可能出现一些问题。以下是常见问题及其潜在解决方案：

  1.非特异性结合

  问题：背景信号高或非特异性结合。

  解决方法：优化阻断条件和洗涤步骤。

  2.低灵敏度

  问题：目标抗原检测不佳。

  解决方案：检测前30分钟将所有试剂放置于室温下，以一定角度移液，不要接触孔底，对样品进行连续稀释，使其处于可检测范围内

  3.结果不一致

  问题：重复或测定之间的差异性。

  解决方案：标准化协议，确保试剂质量的一致性（例如，批次间差异），并保持严格的环境控制（例如，温度）。

  抗体验证是ELISA开发的关键组成部分，可确保检测结果的可信度。通过遵循特定应用的验证策略并遵守既定指南，研究人员可以显著提高实验结果的可靠性。