原代细胞纯化难题？这些方法帮你搞定！

  原代细胞是从生物组织或器官直接分离和培养的细胞，是细胞研究中不可获取的一环。原代细胞通常混杂着多种细胞类型，需要根据实验目的分离出特定类型的细胞。原代细胞分离和纯化在初期细胞培养时比较关键。下面上海通蔚生物介绍原代细胞纯化方法，原代细胞纯化方法如下：

  自然纯化法：

  原代细胞在传代培养过程中会受到培养条件的影响，例如生长因子、培养基成分等，一些细胞类型可能在特定条件下具有更强的增殖能力，从而在培养体系中富集，形成所谓的‘自然纯化’。这种方法的缺陷在于无法自由选择要培养的细胞，并且无法保证获得高纯度的特定细胞类型。因此，需要结合人工纯化方法，例如免疫磁珠分离、流式细胞术等，才能有效地分离出目标细胞，并确保其纯度和特性。

  人工纯化法：

  人工纯化方法在细胞纯化方面应用广泛，它通过各种技术手段，例如酶消化纯化法和机械刮分法等，利用细胞本身的特性，或者根据细胞的特定性质，实现对目标细胞的富集和分离。

  一、酶消化纯化法

  利用特定的酶，例如胰蛋白酶、胶原酶等，来降解细胞之间的连接，从而将组织分离成单个细胞。这个过程需要人工控制酶的浓度、消化时间等，才能获得最佳效果。这种纯化方法不仅适用于贴壁细胞，同样适用于半贴壁细胞和黏附细胞等。

  酶消化纯化法步骤：

  1.准备工作：

  将细胞培养瓶置于37℃培养箱中预热至室温。

  将0.25%胰蛋白酶溶液置于37℃水浴中预热至室温。

  准备适量的完全培养基，并置于37℃水浴中预热至室温。

  2.酶消化：

  将原有培养基从细胞培养瓶中吸出，用PBS缓冲液清洗细胞一次。

  加入1-2mL预热的0.25%胰蛋白酶溶液，轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶覆盖细胞表面。

  将培养瓶置于37℃培养箱中消化，消化时间根据细胞类型和培养密度而定，通常为5-15分钟。

  在显微镜下观察细胞形态，当大部分细胞从培养皿中脱落，呈圆形状态时，即可停止消化。

  3.终止消化：

  加入等量的预热的完全培养基，终止胰蛋白酶消化。

  轻轻摇动培养瓶，使细胞悬液均匀分布。

  将细胞悬液转移至离心管中。

  4.离心：

  将离心管置于离心机中，以1000rpm离心5分钟，收集细胞沉淀。

  5.重悬细胞：

  吸出上清液，加入适量的新鲜完全培养基，轻轻吹打细胞沉淀，使细胞重悬。

  6.计数细胞：

  使用血球计数板计数细胞数量，确定细胞浓度。

  7.接种细胞：

  将适量的细胞悬液接种到新的培养瓶或培养皿中，继续进行培养。

  8.传代培养：

  当细胞生长至80-90%汇合度时，需要进行传代培养，重复上述步骤。

  二、机械刮分法

  机械刮分法则是利用工具，例如刮刀或刷子，将细胞从培养皿或组织上刮下来，从而实现分离。这个过程也需要人工操作，需要控制刮分的力度和范围，避免损伤细胞。

  机械刮分法步骤：

  1.准备工作：

  将培养瓶置于显微镜下观察，确定目标细胞类型和生长区域。

  准备合适的培养基，并置于37℃水浴中预热至室温。

  选择合适的刮刀或刷子，并进行消毒处理。

  2.机械刮分：

  用无菌的刮刀或刷子，轻轻刮取非目标细胞所在的区域，使其悬浮于培养基中。

  操作时要注意力度，避免损伤目标细胞。

  可以分多次进行刮分，每次刮取一小部分非目标细胞，直到将非目标细胞尽可能地分离出来。

  3.冲洗：

  使用无菌的吸管吸取培养基，将刮分下来的非目标细胞悬液转移到离心管中。

  用新鲜的培养基冲洗培养瓶，确保将剩余的非目标细胞冲洗干净。

  4.离心：

  将离心管置于离心机中，以1000rpm离心5分钟，收集细胞沉淀。

  5.重悬细胞：

  吸出上清液，加入适量的新鲜完全培养基，轻轻吹打细胞沉淀，使细胞重悬。

  6.接种细胞：

  将细胞悬液接种到新的培养瓶或培养皿中，继续进行培养。

  7.重复操作：

  如果需要进一步提高细胞纯度，可以重复上述步骤，直到获得满足实验要求的纯度。

  三、反复贴壁培养法

  反复贴壁培养法是一种利用细胞的贴壁特性进行细胞纯化的方法，也称为差速贴壁法。

  反复贴壁培养法步骤：

  初始培养：将混合细胞接种到培养皿中，培养一段时间，使贴壁能力强的细胞附着在培养皿底部。

  去除悬浮细胞：将培养基和悬浮细胞吸出，留下贴壁的细胞。

  重新培养：加入新的培养基，继续培养贴壁细胞。

  重复步骤：重复步骤2和3，将悬浮细胞去除，并将贴壁细胞进行再次培养。

  纯化：经过多次重复步骤后，贴壁能力强的细胞会逐渐富集，最终获得相对纯化的细胞。

  上述是原代细胞的分离和纯化方法介绍，具体选择哪种纯化方法要结合细胞类型和实验需求进行选择。上海通蔚生物祝福您在原代细胞纯化中更上一层楼。