酶联免疫试剂盒：夹心ELISA

  酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种分析生物化学技术，能够检测和量化可溶性物质，例如肽、蛋白质、抗体和激素。本文上海通蔚详细为您介绍下夹心ELISA法。

  ELISA优势很多，可以有效处理大量的样本。这些高度特异性和灵敏的检测可以检测出低至每毫升0.01纳克的抗原或抗体浓度。在ELISA实验过程中，抗原-抗体复合物被固定在固体表面上。酶与复合物中的一个分子共价连接，添加酶特异性底物会产生可量化的有色反应产物。

  在进行ELISA实验过程，选择合适的ELISA类型非常重要，常见的ELISA类型有直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA法等。其中夹心ELISA法为检测目标分析物提供了无与伦比的灵敏度和特异性。相关阅读：《elisa试剂盒有哪几种类型？elisa四类型图解》

  夹心ELISA法

  直接夹心ELISA通过将抗原捕获在两种特异性抗体之间来检测抗原。夹心法ELISA主要组成如下：

  1.微孔板：通常为96孔板，根据检测结果具有高结合力或中等结合力。

  2.捕获抗体：特定蛋白质结合的单克隆、多克隆或重组抗体。

  3.包被缓冲液：通常使用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）或PBS（pH7.4）用于蛋白质吸附。

  4.样品和标准溶液：抗原或其他目标蛋白。ELISA的常见样品类型是血清、血浆、细胞上清液、尿液、唾液、组织匀浆和脑脊液。

  5.封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉或商业封闭溶液，以防止非特异性结合。

  6.检测抗体：与捕获抗体结合到目标抗原上的不同表位并且是酶偶联的（例如辣根过氧化物酶，HRP）单克隆、多克隆或重组抗体。

  7.底物溶液：HRP的TMB（3,3'，5,5'-四甲基联苯胺）或其他酶的合适底物。

  8.终止液：通常为1N硫酸（用于TMB）。

  9.洗涤缓冲液：含Tween-20（0.05%）的PBS或Tris缓冲盐水(TBS)。

  10.移液器和吸头：用于精确测量体积。

  11.平板读取器：用于检测吸光度或荧光。

  夹心ELISA法流程

  步骤1：涂覆板材

  首先用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中浓度为1-10µg/mL的捕获抗体包被微量滴定板的孔。应用抗体后，将微量滴定板在4°C下孵育过夜，使抗体吸附到孔中。

  第2步：阻断

  去除包被溶液后，通过向每个孔中添加封闭缓冲液（例如PBS中的1%BSA）来封闭剩余的蛋白质结合位点。将板在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜，以防止非特异性结合。去除封闭缓冲液并用PBS清洗3-5次，以帮助去除任何未结合的封闭剂。这是降低后续步骤中非特异性结合可能性的关键。

  为什么要阻断？包被ELISA板是一种被动结合过程，其中生物分子被固定在孔表面上。如果不进行封闭，抗原或检测抗体可能会非特异性地与板结合，导致背景高和灵敏度低。封闭会使自由结合位点饱和，从而防止非特异性相互作用。使用比反应体积（100µl）更高的封闭体积（200µl）可确保全面覆盖。

  步骤3：添加样品和标准品

  向每个孔中添加100µL稀释样品（例如血浆、血清或细胞裂解物）。确保样品在稀释或封闭缓冲液中适当稀释，浓度在测定的预期动态范围内（通常在1-100ng/mL之间）。将板在37°C下孵育90分钟或在4°C下孵育过夜。

  ELISA控制的重要性是什么？包括阳性和阴性对照对于验证检测的准确性至关重要。阳性对照可确认检测工作正常，而阴性对照可提醒您注意假阳性或非特异性结合。

  步骤4：清洗

  在每个步骤之间，特别是在与样品和抗体一起孵育后，用PBS清洗培养皿几次以去除任何未结合的物质。

  步骤5：添加检测抗体

  每孔加入100µL（通常为0.1-1µg/mL）稀释的偶联检测抗体，室温孵育2小时。务必用PBS清洗板3-5次，以去除未结合的检测抗体。

  步骤6：添加底物

  洗涤后，将酶底物加入到每个孔中。底物与检测抗体偶联的酶发生反应，产生可测量的颜色变化。例如，TMB通常与HRP一起使用，反应15-30分钟后加入硫酸终止。

  步骤7：读取结果

  使用微孔板读数仪在适当的波长（例如TMB为450nm）下测量每个孔的光密度。颜色变化的强度与样品中抗原的浓度成正比，可以通过使用已知浓度的抗原标准品将其与标准曲线进行比较来量化（图3）。

  实验注意事项

  1.小心处理样本：避免反复冻融，因为这会降解敏感蛋白质并影响检测结果。与样本收集和处理的方法保持一致。

  2.使用前将所有试剂放置至室温：进行ELISA时，务必将所有试剂放置至室温，除非实验方案明确规定不要这样做。这将有助于确保结合动力学在测定之间保持一致，并将对温度敏感的成分保持在溶液中。

  3.娴熟移液技术：最佳实践建议包括选择适合要添加的体积的移液器、以一定角度握住移液器尖头分配液体且不接触孔底，并始终在不同的样品或标准之间更换移液器尖头以避免交叉污染。

  4.遵守方案：为了获得可重复的结果，遵守方案至关重要，无论是试剂盒提供的方案还是内部方法。这包括与样品制备方式保持一致，始终使用优化的检测条件，并遵守孵育时间和温度。一般来说，建议孵育时间每小时的差异不超过+/-5分钟。

  5.结合对照和参考标准：对照用于数据分析和验证检测性能。建议将对照放置在能够突显任何板漂移的位置（例如，96孔板的第1列和第12列通常用作对照孔，阳性对照位于A1-D1和E12-H12孔中，阴性对照位于E1-H1和A12-D12孔中）。

  解决常见问题

  1：高背景信号

  可能的原因：由于阻断不充分导致非特异性结合。

  解决方法：增加封堵剂浓度或延长封堵时间。

  2：信号低或无信号

  可能的原因：目标蛋白或抗体的涂层不足。

  解决方案：确保适当的涂层浓度并留出足够的孵育时间。

  3：结果不一致

  可能的原因：样品处理或培养时间的变化。

  解决方案：标准化样品处理程序，严格遵守所有步骤的时间安排。

  4：井间变异性高

  可能的原因：移液不均匀或孔填充不一致。

  解决方案：使用校准的移液器，并确保在分配前彻底混合溶液。

  上述通蔚为大家介绍ELISA检测方法，夹心ELISA法在科研领域应用比较广泛，了解夹心ELISA法及步骤，可以使用夹心ELISA获得可靠、可重复的结果。