【通蔚生物】：ELISA试剂流式细胞术知识分享

在流式细胞术中会使用多种荧光试剂，包括荧光偶联抗体、DNA结合染料、活性染料、离子指示剂染料和荧光蛋白。在过去的几年里，由于相关试剂种类和数量的增加，用于流式细胞术实验的参数数量发生了爆炸性增长。比如，用于偶联单克隆抗体的荧光染料，如串联染料和聚合物染料的数量急剧增加。此外，除了GFP之外，可用于转染的荧光蛋白也有所增加，如mCherry、mBanana、mOrange、mNeptune等。本文就为大家介绍一下常用的流式荧光试剂。

有机小分子

有机小分子如荧光素(MW=389 D)、Alexa Fluor 488(荧光素类似物)、Texas Red (325 D)、Alexa Fluor 647 (1464 D)、Pacific Blue和Cy5 (762 D)通常用于抗体偶联。它们具有一致的发射光谱，但有一个小的Stokes位移(激发波长和发射波长之间的差，约50-100 nm)。有机小分子很稳定，且很容易与抗体结合。目前，一些染料（例如Alexa Fluor, Thermo Fisher）经过特殊设计，可减小成像时的光漂白效应，是样品需要成像分析时更好的试剂选择。

藻胆蛋白

藻胆蛋白是来源于蓝藻、鞭毛藻等藻类的大型蛋白质分子。藻胆蛋白的分子量大（例如藻红素(PE)的分子量为240kD），非常适合于定量流式细胞术，因为它们在偶联过程中通常有1:1的蛋白质与荧光色素比例。藻胆蛋白具有较大的Stokes位移(75-200 nm)和稳定的发射光谱。然而，藻胆蛋白易受光漂白效应影响，不建议长时间或反复暴露于激发光源。常用的藻胆蛋白有藻红蛋白(PE)，藻蓝蛋白(APC)和叶绿素蛋白(PerCP)等。
藻红素及其辅因子结构示意图

量子点

量子点 (Qdots) 是半导体纳米晶体，具有与纳米晶体尺寸相关的紧密荧光发射光谱。它们最适合用紫外或紫色激光激发，但也可能被多个激光最低限度地激发。当 Qdots 用于多参数实验时，这种最小激发使荧光补偿复杂化。由于补偿问题和难以结合抗体，Qdots在多参数染色面板中已在很大程度上被聚合物染料取代。

高分子聚合物染料

聚合物染料由收集光信号的聚合物链组成，可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基，吸收和发射特定波长的光。聚合物染料非常稳定，具有与藻胆蛋白相似的量子效率，且光稳定性大大提高。由于聚合物染料只能吸收特定波长的光，因此避免了量子点试剂在多参数实验中难以进行多次激光激发的问题。常见的聚合物染料有亮紫(BV)、亮紫外(BUV)和亮蓝(BB)试剂。

串联染料

串联染料由藻胆蛋白（PE、APC、PerCP）或聚合物染料（BV421、BUV395）与小的有机荧光染料（Cy3、Cy5、Cy7）化学偶联而成，可用单个激光源进行激发，这种染料增加了可由单个激光激发的荧光染料的种类。例如，Texas Red的最大激发波长为589 nm，PE的发射波长为585 nm，因此通过将PE偶联到Texas Red， PE的发射光通过荧光能量转移（FRET）激发Texas Red，使PE-TxRed串联染料可以被488 nm或532 nm激光激发。聚合物链抗体使用相同的方法来增加可由单个激光激发的荧光染料。串联染料非常明亮，具有较大的Stokes位移值 (150-300 nm)，这在处理低抗原密度样本时非常有用。然而，串联染料的稳定性不如供体荧光染料，而且它们的能量转移效率因批次而异，使补偿变得复杂。大多数较长的Brilliant聚合物染料也是串联的，也存在上述问题。