ELISA试剂盒：如何优化您的 ELISA 实验

  酶联免疫吸附实验（ELISA）是目前免疫实验较为灵敏、可重复的技术之一。它快速、简单易于自动化。与其它实验一样，ELISA实验可重复性和可靠性取决于适当的技术和细节的关注。

  ELISA常见的技术类型

  ELISA常见的技术类型分为直接ELISA、间接ELISA和夹心ELISA。

•   直接ELISA，其中抗原固定在ELISA板上，并且一抗带有标记（图1A）

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•   间接ELISA，其中抗原固定在ELISA板上，二抗带有标记（图1B）
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•   夹心ELISA，其中两种一抗（用于捕获和检测）嵌入抗原，形成“夹心”，然后复合物被二抗识别（图1C）。
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  ELISA试剂盒中匹配的抗体对

  配对抗体是指已知可识别同一蛋白质抗原上的不同表位的抗体组，因此它们可以一起用于在夹心ELISA中捕获和检测单一抗原。ELISA检测中使用的抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或两者的组合。

  单克隆抗体可用于所有类型的ELISA中所有含抗体的步骤。它们通常以匹配对的形式成套用于夹心ELISA，但可以与多克隆抗体一起用于捕获或检测，以增强信号或提供更大的机会从复杂溶液中捕获抗原。

  由于多克隆抗体溶液中存在的抗体异质性以及表位的广泛代表性，多克隆抗体可以成为检测抗原的有力工具，通常比单克隆抗体产生更高的信号水平。然而，多克隆抗体更有可能与密切相关的蛋白质共享一个或多个表位，从而产生更高的非特异性信号。减少此问题的一种方法是使用亲和力纯化或交叉吸收的多克隆抗体。为了提高检测灵敏度，ELISA的检测方法可以从直接检测转换为使用多克隆抗体的间接检测。相关阅读：《单克隆 vs 多克隆抗体：科研实验中的抉择》

  ELISA样本

  ELISA可以检测多种样本，检测条件的选择取决于样本的复杂性和预期存在的抗原量。

  重要的是，要结合已知标准对所有样本进行两次或三次测试，以确保结果和定量的准确性。最好对样本进行多次稀释测试，以确保最终结果在标准曲线的线性部分内。高浓度样本可能会低估浓度，而高度稀释的样本可能会高估浓度。

  ELISA封闭和清洗步骤

  封闭通常是必要的，以防止检测抗体与多孔板表面本身的非特异性结合。当板完全封闭时，检测灵敏度将增强，因为非特异性信号将减少。

  彻底清洗程序对于获得可靠的ELISA结果至关重要。重要的是，通过轻轻将吸液头放入底部，将所有孔中的液体完全吸出。避免刮伤孔内。清洗完成后，建议将板倒置并用吸水纸擦干。

  如何优化您的ELISA实验

  ELISA实验准确性有助于实验结果的可靠性，下面结合日常ELISA实验操作来优化几点建议：

  1）捕获抗体浓度

  在包被缓冲液中制备不同浓度的捕获抗体。

  2）阻断缓冲液

  准备不同的封闭液。如果封闭液不是预先配制的（即它是单一蛋白质，例如BSA），请尝试不同浓度的蛋白质。

  3）标准稀释剂

  尝试使标准稀释剂与样品基质尽可能接近匹配。

  如果基质本身无法精确复制，则测试不同的标准稀释液，并检查样品的标准曲线和稀释线性。可能需要选择不同的稀释剂。

  如果样品的线性较差，则样品基质和标准稀释剂之间可能存在不平衡。在这种情况下，应进行加标回收或稀释线性实验。

  4)样品浓缩

  制备不同浓度的样品，注意底物的检测限。为了确认生物样品基质不会掩盖或增强信号，应进行加标回收和稀释线性实验。

  5）检测抗体浓度

  制备不同浓度的检测抗体。

  6）酶结合物浓度

  根据ELISA试剂盒中针对底物描述的范围，制备不同浓度的酶结合物。

  7）信号检测

  根据样品中的抗原量以及用平板读取器检测的能力来选择底物。

  如果可以清楚地检测到抗原则表明底物是合适的。

  如果抗原低于检测阈值，则选择更敏感的底物。

  常见的ELISA问题

  下面上海通蔚为大家汇总了常见ELISA问题，了解这些问题有助于后期在实验中减少出错的概率。

  1)ELISA检测信号弱或无信号

  建议在开始检测前将所有试剂放置于室温下15-20分钟。

  组件储存不正确。仔细检查试剂盒标签上的储存条件。大多数试剂盒需要储存在2–8oC的环境中。

  试剂添加/制备不正确。检查方案，确保试剂以正确的顺序添加，并准备正确的稀释度。

  荧光试剂过度曝光。强光会分解荧光团，导致光漂白。保护荧光团免受光照对于在检测结束时有效产生信号至关重要。

  组分需要进一步优化。检测的某一组分可能处于限制浓度，导致整体信号较低。

  试剂降解。其中一种试剂可能已降解或被污染，这种情况下应予以更换。

  抗体配对效率低或对靶标缺乏足够的亲和力。所用的抗体可能无法有效地与抗原结合，或可能无法相互结合发挥作用。在这种情况下，必须测试替代抗体。

  检测系统需要进一步优化。检测系统（底物）可能不够灵敏，无法发出信号，或者标准曲线可能不适合该样品。可能需要浓缩样品或切换到更灵敏的底物。

  2）背景高

  清洗或封闭不充分。高背景信号通常是由于清洗或封闭不充分、样品成分或抗体与封闭缓冲液发生交叉反应，或者使用了过多的酶结合物造成的。

  平衡产生特定信号的酶量与产生背景信号的酶量非常重要。控制这一点的最有效方法是优化酶结合物、抗体和封闭液。

  3）标准曲线线性差

  如果标准曲线的线性较差，则样品必须在严格的浓度范围内才被视为准确的。

  如果曲线具有良好的线性，但重复之间的变化较差（即标准误差），则可能存在技术问题，例如样品或个人用户之间的移液不一致。

  为了缓解此问题，应至少对所有样品和标准进行两次或三次测量。

  4)ELISA信号过高

  清洗不充分。为了避免此问题，请使用适当的清洗程序，例如，在每个清洗步骤结束时，将板倒置在吸水纸上并使其完全排干，必要时用力拍打以去除任何残留液体。

  孵育时间过长。孵育时间过长也是ELISA信号过高的原因之一；务必遵循建议的孵育时间。

  污染。使用板密封剂可避免此问题，每次打开板时都使用新的密封剂。这将防止孔相互污染。