探针法 PCR 工作原理详解：从荧光到基因定量

  上篇我们认识qPCR，对比PCR之间区别，知道qPCR，你应该接触到染料法PCR和荧光探针法PCR。它们都属于qPCR（实时定量PCR技术）。今天，主要讲下探针法PCR工作原理，对探针法PCR有个全面的认识。关于qPCR，可以参考《qPCR：实时定量 PCR 技术》

  什么是探针法PCR?

  探针法的qPCR是一种PCR方法，它使用荧光标记的序列特异性DNA寡核苷酸（称为探针）来获得非常准确和特异的结果。使用探针不仅需要设计引物，还需要设计探针（下文有介绍），这可能会使实验比使用基于染料的qPCR更加耗时和昂贵。

  探针法PCR是如何工作？

  再开始使用探针的qPCR，您需要的探针在其一端包含荧光报告染料，在另一侧包含猝灭元件，通过吸收报告基因发出的光来防止荧光。荧光报告染料和猝灭剂的位置彼此靠近，以便猝灭剂阻止荧光。在设计引物和探针时考虑引物和探针的位置也很重要。探针应位于序列中间的引物之间。在PCR过程中，探针定位引物下游并与互补靶标结合。然后，荧光报告染料和猝灭剂被TaqDNA聚合酶分离，该酶会裂解探针。这使得荧光信号被释放，qPCR机器将测量该信号，然后用于定量样品中的DNA量。（图1）

图1 TaqMan 探针法原理示意图

  这种方法的好处是您可以确定信号来自预期目标，因为只有引物和探针与正确的序列结合时您才能获得信号。前提是探针和引物设计良好并且不会非特异性地结合到其他地方。

  除了更高的特异性（与基于染料的qPCR相比）之外，基于探针的qPCR还可以节省反应完成后分析qPCR结果的时间，因为您不需要弄清楚您正在查看的是否正确目标放大与否。由于探针的特异性，如果您没有大量目标材料或想要检测目标中的微小变化（如SNP（单核苷酸多态性）），它们也很有用。

  如前所述，基于探针的qPCR可用于多重检测。这意味着通过使用携带不同报告染料的不同标记探针可以在单个反应中检测多个序列。由于在不同通道中检测到不同的荧光团，因此稍后可以区分哪一个目标被扩增。与使用单重分析相比，这可以使实验更快、更便宜。尽管如此，重要的是要记住在混合物中添加更多的反应组分或使用专为多重检测而设计的指定试剂，这样就不会出现竞争，从而限制一个或多个目标的扩增。

  如何设计探针？

  探针法PCR最困难的部分可能是设计探针。一旦完成，其他一切实际上与基于染料的qPCR（后期要讨论的）没有什么不同。

  当开始设计探针时，明智的做法是同时记住引物，以避免自我互补并确保其对靶标的特异性。运行BLAST比对很可能会对此有所帮助。您还可以尝试其他软件，如SnapGene、Benchling等。探针的位置应靠近引物（约50bp），但不能重叠。应以中等量（~50%）的GC含量为目标，以允许复杂性，同时保持独特的序列。此外，探针不应太长（~30bp），否则将难以正确猝灭荧光。探针的熔解温度应略高于引物(8-10°C)，以确保更好的灵敏度。在循环程序中，退火温度应设置为比引物熔解温度下限低最多5°C，以实现特异性结合。大多数探针设计程序也会告诉您要记住这些建议，但根据实验的不同，可能需要进行优化。

  在计划多重实验时，设计带有报告荧光团的探针非常重要，这些荧光团具有足够不同的激发和发射波长，以便qPCR机器可以区分它们。猝灭剂还必须与报告基因相匹配。此外，请确保您的qPCR机器实际上能够读取所有荧光团信号，以及您是否拥有无ROX、高ROX或低ROX机器。

最后您应该知道qPCR有不同的探针变体，这些变体也有变体，这些变体有修改，所以确实有很多选项可供选择。最流行的是水解探针（例如TaqMan®），它们有利于定量和多重分析。然后还有分子信标，它们被认为更具特异性，可用于SNP检测等。

上述是探针法 PCR 工作原理详解，内容比较多和抽象，大家看完文章后可以对照自己的实验进行操作，通过实验加深原理的理解。如果对探针法PCR还有疑问，可以寻求在线技术顾问帮助。如果您想了解更多探针法PCR试剂盒，欢迎前来咨询。