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PCR扩增技术入门:检测试剂盒PCR扩增的原理和步骤

发布时间:2024-03-04     发布作者:上海通蔚生物

  检测试剂盒应用领域非常的广泛,包括医学诊断、生物科学实验和环境和食品安全检测。今天,上海通蔚生物给大家说一说生物科学实验PCR试剂盒。PCR(聚合酶链式反应)这项技术是由美国生物化学家卡里·穆利斯 (Kary Mullis) 于 1983 年开发的。
  

  卡里·穆利斯 (Kary Mullis)

卡里·穆利斯 (Kary Mullis)

  
  说起PCR,除了实验室人比较熟悉之外,就是近年来的新冠(Covid-19 )一部分采样的PCR技术,通过此技术可以确认一个人是否感染病毒。
  

  检测试剂盒PCR(聚合酶链式反应)

  
  聚合酶链式反应 (PCR) 是一种用于医学和分子生物学研究的技术,可复制DNA 片段(例如特定基因)的数千甚至数百万个副本。它还可用于检测基因是否存在,以帮助识别感染过程中的病原体。例如,在Covid-19大流行期间,PCR检测被用来检测一个人的拭子样本是否含有病毒遗传物质的片段,以提供阳性或阴性感染结果。
  

  检测试剂盒PCR工作原理及步骤

  

  PCR工作原理

  

  PCR 使用 DNA 聚合酶指导从单链 DNA 模板上的脱氧核苷酸底物合成 DNA。当定制寡核苷酸与更长的模板 DNA 退火时,DNA 聚合酶将核苷酸添加到定制寡核苷酸的 3` 端。因此,如果合成的寡核苷酸与包含与寡核苷酸互补的区域的单链模板退火,DNA聚合酶可以使用寡核苷酸作为引物并延长其3'端以产生双链DNA的延伸区域。


PCR工作原理

  

  PCR五个核心“原料”

  
  1、要复制的 DNA 模板。
  
  2、引物——DNA 或 RNA 的短片段,长度为 20 到 30 个碱基,结合感兴趣的 DNA 片段的任一侧并标记 PCR 的起始点。
  
  3、DNA 核苷酸碱基(也称为 dNTP)。DNA 碱基(A、T、C 和 G)是 DNA 的组成部分,是构建新 DNA 链所必需的。
  
  4、一种称为 Taq 聚合酶的酶,它将碱基添加到复制的序列中。
  
  5、缓冲液以确保反应有合适的条件。
  

  PCR三个主要阶段步骤

  
  步骤1,变性:将双链模板DNA加热,使其分离成两条单链。
  
  步骤2,退火:降低温度,使DNA引物附着到模板DNA上。
  
  步骤3,延伸:再次升高温度,Taq聚合酶产生新的DNA链。
  
  这三个阶段重复 20-40 次,每次 DNA 拷贝数加倍。这称为热循环,由机器执行。
  
  它是由一台称为热循环仪的机器执行的。根据机器的速度,PCR 可以在不到一小时或长达几个小时内完成。
  

  PCR 完成后,可以使用一种称为电泳的方法来检查产生的 DNA 片段的数量和大小。


PCR步骤


  

  PCR每个阶段会发生什么?

  

  第一步:变性   


  将反应混合物加热至 94-95°C,持续 15 至 30 秒。
  
  高温导致模板 DNA 两条链中碱基之间的氢键断裂,两条链分离。
  
  这会产生两条单链 DNA,它将作为模板产生每条 DNA 链的新副本。
  
  重要的是,在此阶段保持温度足够长的时间,以确保 DNA 链完全分离。
  
  第 2 步:退火
  
  将反应冷却,使引物能够通过氢键连接到单链模板 DNA 上的特定位置。
  
  温度取决于底漆的特性,但通常在 50 至 65⁰C 之间。
  
  两条分离的 DNA 链是互补的,并且以相反的方向延伸(从一端 – 5' 端 – 到另一端 – 3' 端)。因此,有两种引物——正向引物和反向引物。
  
  此步骤至关重要,因为引物通过提供供聚合酶使用的短双链 DNA 区域而充当 DNA 合成的起点。只有引物结合后,聚合酶才能附着并开始在延伸步骤中从松散的 DNA 碱基生成新的互补 DNA 链。
  
  退火步骤通常需要大约10-30秒。
  
  第三步:扩展
  
  热量升至 72⁰C,以便通过添加 DNA 碱基的特殊 Taq DNA 聚合酶生成新 DNA。
  
  Taq DNA 聚合酶是一种取自水生栖热菌 (“Taq”) 的酶:这种细菌通常生活在温泉中,可以耐受80℃以上的温度,但最适温度为72℃。
  
  该细菌的 DNA 聚合酶在高温下非常稳定,这意味着它可以承受在 PCR 变性阶段将 DNA 链分开所需的温度。
  
  大多数其他生物体的 DNA 聚合酶无法承受如此高温。例如,人类聚合酶在 37°C(体温)下工作效果最佳。
  
  在 72⁰C 时,Taq 聚合酶开始构建互补链。它附着在引物上,然后沿 5' 到 3' 方向将 DNA 碱基一一添加到单链上。
  
  结果是一条全新的 DNA 链和双链 DNA 分子。
  
  此步骤的持续时间取决于被扩增的 DNA 序列的长度。复制 1,000 个 DNA 碱基通常需要大约一分钟。
  
  重复该过程
  
  这三个热循环过程重复 20-40 次,以产生大量感兴趣的 DNA 序列的副本。
  
  PCR 过程中产生的新 DNA 片段也可以作为 DNA 聚合酶可以附着并开始产生 DNA 的模板。
  
  结果是在相对较短的时间内产生大量特定 DNA 片段的拷贝。
  
  检测试剂盒PCR扩增的原理和步骤介绍到这里。这些原理对于初次实验新手理解起来并非容易,要结合实验反复测试。如果有实验问题,欢迎前来交流!
  

  上海通蔚生物PCR试剂盒设计人性化,操作简便,无需复杂的前处理步骤,即可快速完成样本的PCR扩增。同时,试剂盒具有高灵敏度和特异性,能够准确检测目标DNA或RNA序列,为科研和诊断提供有力支持。

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