ELISA实验原理及步骤：从入门到精通

  ELISA是酶联免疫吸附分析的缩写。在这种实验方法中，使用免疫吸附剂（与固体表面结合的抗原或抗体）和酶联免疫反应物。例如，ELISA用于利用未标记的未知物和标记的反应物之间的竞争性结合来检测未知浓度。ELISA不但成为了一种非常简便的研究工具，而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测，并在临床应用中逐步取代了放免技术。下面上海通蔚为大家全面了解ELISA实验原理、步骤和注意事项.

  ELISA试剂盒原理

  ELISA（酶联免疫吸附测定） 是一种将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种综合性技术。其基本原理是利用抗原抗体反应的特异性，将待测物质与酶标记的抗体或抗原结合，通过酶催化底物显色反应，根据颜色深浅进行定性或定量分析。根据抗原抗体反应的结合方式，有直接法、间接法、夹心法、竞争法等。下面详细介绍：

  直接ELISA

  在直接ELISA中，待测抗原被吸附到反应板的孔中，并进行洗涤去除未结合的抗原。随后，添加酶标记的抗体，该抗体能够特异性识别抗原。抗体与抗原结合后，加入底物溶液，酶催化底物发生颜色变化，颜色变化的程度与样本中抗原的含量成正比。


  优缺点分析:

  1.优点:

• 操作简单快速：直接ELISA仅使用一种抗体，步骤较少，减少了误差的可能性，提高了实验效率。

• 避免交叉反应：直接ELISA不使用第二抗体，因此可以避免第二抗体与其他抗体的交叉反应，提高检测的特异性。

  2.缺点:

• 抗体标记难度：为每种抗原准备相应的标记抗体，需要额外的时间和成本。

• 灵敏度较低：由于标记抗体的密度较低，直接ELISA的灵敏度可能低于间接ELISA。

  在直接ELISA法中，为了提高直接ELISA法的灵敏度，可以尝试以下几种方法：

  1.使用高亲和力的标记抗体：

  选择与抗原结合能力更强的标记抗体，可以提高抗原的识别效率，从而提高灵敏度。

  可以使用单克隆抗体，因为单克隆抗体具有更高的特异性和亲和力。

  2.优化标记方法：

  可以尝试不同的标记方法，例如使用更有效的酶或荧光标记物，以提高标记效率和灵敏度。

  可以尝试对抗体进行优化，例如改变抗体的结构或进行修饰，以提高其标记效率。

  3.提高抗原的包被密度：

  在进行ELISA实验时，可以通过增加抗原的包被浓度或延长包被时间，提高抗原在反应板上的吸附密度，从而提高检测灵敏度。

  4.使用信号放大技术：

  可以使用一些信号放大技术，例如生物素-链霉亲和素系统，来放大信号，提高检测灵敏度。

  5.使用更灵敏的检测方法：

  可以使用更灵敏的检测方法，例如化学发光检测法，来提高检测的灵敏度。

  6.优化实验条件：

  优化实验条件，例如调整孵育时间、洗涤步骤、底物浓度等，可以提高实验的效率和灵敏度。

  7.使用更敏感的试剂盒：

  选择专门为提高灵敏度设计的直接ELISA试剂盒，例如使用高灵敏度的酶标记抗体或高灵敏度的底物。

  间接ELISA

  间接ELISA使用两种抗体：第一抗体（一抗）特异性识别待测抗原，第二抗体（二抗）特异性识别一抗。首先，待测抗原被吸附到反应板的孔中，并进行洗涤去除未结合的抗原。然后，加入一抗，一抗与抗原结合。接着，加入酶标记的二抗，二抗与一抗结合。最后，加入底物溶液，酶催化底物发生颜色变化，颜色变化的程度与样本中抗原的含量成正比。


  优缺点分析:

  1.优点:

• 降低成本：可以利用同一物种的多种一抗，并使用相同的标记二抗进行检测，降低实验成本和工作量。

• 提高灵敏度：由于一抗未被标记，可以保持其天然的免疫活性，提高检测的灵敏度。此外，高密度的二抗标记能够放大信号，进一步提高检测灵敏度。

  2.缺点:

• 存在交叉反应：二抗可能与其他抗体发生交叉反应，导致非特异性信号，降低检测结果的准确性。

• 延长实验时间：间接ELISA需要额外的孵育步骤，增加了实验时间。

  在间接ELISA法中，为了避免存在交叉反应，要注意：

  1、选择高纯度的二抗：高纯度的二抗可以降低杂质抗体存在的可能性。

  2、选择对一抗具有高度特异性的二抗：这样可以确保二抗只与一抗结合，而不会与其他抗体结合。

  3、进行对照实验：在进行ELISA实验时，需要设置对照组，排除二抗的交叉反应造成的假阳性结果。

  夹心ELISA

  夹心ELISA需要使用两对抗体，分别识别抗原的不同表位，而且这两个表位不能重叠。首先，将捕获抗体固定在反应板的孔中。然后，加入待测样本，如果样本中含有待测抗原，抗原就会与捕获抗体结合。接着，加入酶标记的检测抗体，它能够识别与捕获抗体结合的抗原。最后，加入底物溶液，酶催化底物发生颜色变化，颜色变化的程度与样本中抗原的含量成正比。


  优缺点分析:

  1.优点:

• 高特异性：由于使用两种针对同一抗原不同表位的抗体，夹心ELISA具有很高的特异性，可以有效地识别并检测目标抗原。
• 适用范围广：夹心ELISA适用于复杂或粗/不纯的样品，无需对抗原进行预处理，可以直接进行检测。
• 灵敏度高：夹心ELISA的灵敏度较高，可以检测微量的抗原。

  2.缺点:

• 需要定制开发抗体：如果市面上没有现成的配对抗体，就需要定制开发，这会增加时间和成本。

  竞争ELISA

  竞争性ELISA是一种用于测量样本中抗原或抗体浓度的免疫学检测方法，特别适用于检测小分子抗原或抗体。它的原理是：将待测样本中的抗原或抗体与已知浓度的标记抗原或抗体（参考物质）进行竞争性结合，竞争结合到固相载体上的抗体或抗原。样本中的抗原或抗体浓度越高，与标记参考物质竞争结合的量就越少，最终产生的信号强度就越弱。

  优缺点分析:

  竞争性ELISA可以基于直接ELISA、间接ELISA或夹心ELISA的检测方法，因此其优缺点也与所选用的检测方法有关。

  1.优点:

• 高灵敏度：可以检测微量的抗原或抗体。
• 适用于小分子抗原或抗体：可以检测无法直接捕获或检测的小分子抗原或抗体。

  2.缺点:

• 操作复杂：需要额外的步骤来进行竞争性结合反应。
• 需要严格的质量控制：需要确保参考物质的浓度和质量稳定。

  ELISA优缺点

  酶联免疫吸附试验由EvaEngvall和PeterPerlmann于1971年首次描述，是一种广泛使用的分析生物化学实验。与其他免疫测定程序相比，ELISA具有许多优点：

  1、由于其出色的敏感性和特异性而被经常使用。

  2、与放射免疫分析(RIA)测试等其他程序相比，ELISA的准确性更高。

  3、最常见的ELISA检测形式是96孔微孔板。大多数ELISA微孔板都有分开的孔，必要时可以进行小规模的检测。主要优点是一次检测可以进行96次测定，结果通常在3小时内即可得出。这是一种省时且经济的方法。

  4、ELISA不需要使用放射性同位素或昂贵的辐射计数器。只需要精确的微量移液器、培养箱、清洗系统和微孔板分光光度计读数器。

  ELISA缺点：

  ELISA中对免疫原性抗原的抑制不足会导致错误结果。

  由于抗体是蛋白质，因此必须冷藏运输和储存。

  ELISA制备抗体需要大量时间且成本高昂。

  其中出现假阳性和假阴性的概率很高。

  ELISA抗体存在不稳定性。

  ELISA实验步骤

  一、实验准备：

  1.试剂准备：

  IL-1βELISA试剂盒（包含：包被抗体、检测抗体、酶结合物、标准品、底物溶液、终止液、洗涤液等）

  PBS缓冲液(pH7.4)

  蒸馏水

  微量移液器

  吸头

  酶标板

  酶标仪

  孵育箱

  洗板机(可选)

  离心机(可选)

  2.样本准备：

  采集需要检测IL-1β的样本，例如血清、血浆、细胞培养上清液等。

  按照试剂盒说明书的要求处理样本，例如离心去除细胞碎片、稀释等。

  准备好空白对照、标准品和样本。

  3.实验器材准备：

  准备合适的酶标板，通常为96孔板。

  准备移液器、吸头、孵育箱、洗板机、酶标仪等实验器材。

  二、实验步骤：

  1.包被：

  将试剂盒中的包被抗体(捕捉抗体)稀释至合适的浓度，并按照说明书的要求加入到酶标板孔中。

  将酶标板置于4℃冰箱过夜或37℃孵育2小时，使抗体牢固地吸附在酶标板上。

  用洗涤液洗涤酶标板3次，去除未结合的抗体。

  2.封闭：

  将试剂盒中的封闭液加入到酶标板孔中，并按照说明书的要求进行孵育(通常为37℃1小时)。

  封闭液可以阻止酶标板表面非特异性结合，减少实验误差。

  用洗涤液洗涤酶标板3次，去除未结合的封闭液。

  3.加样：

  加入标准品、样本和空白对照(空白对照通常只加入缓冲液，不加样本)到酶标板孔中，每个孔的体积通常为100μL。

  按照说明书的要求进行孵育(通常为37℃1小时)。

  4.洗涤：

  用洗涤液洗涤酶标板3次，去除未结合的物质。

  5.加入酶结合物：

  将试剂盒中的酶结合物(通常为酶标记的检测抗体)稀释至合适的浓度，并加入到酶标板孔中。

  按照说明书的要求进行孵育(通常为37℃1小时)。

  6.洗涤：

  用洗涤液洗涤酶标板3次，去除未结合的酶结合物。

  7.加入底物溶液：

  将试剂盒中的底物溶液加入到酶标板孔中，并按照说明书的要求进行反应(通常为室温避光孵育15-30分钟)。

  酶催化底物发生显色反应，产生颜色变化。

  8.终止反应：

  加入终止液(通常为酸性溶液)，终止显色反应，防止颜色继续加深。

  9.比色：

  用酶标仪测量各孔的吸光度值，并按照试剂盒提供的说明书进行标准曲线的制作，最终计算出样本中IL-1β的浓度。

  10.’注意事项：

  严格按照试剂盒说明书进行操作，不同的试剂盒可能会有不同的操作步骤和参数。

  确保所有试剂和器材处于最佳状态，例如试剂的有效期、酶标仪的校准等。

  注意实验环境，例如温度、湿度、光照等因素会影响实验结果。

  做好实验记录，包括实验日期、试剂批号、样本信息、操作步骤、结果等，便于日后分析和追溯。

  注意实验室安全，例如戴手套、穿实验服、操作规范等。

  上述为大家介绍ELISA实验原理及步骤，通过原理和步骤对ELISA有初步的认识。除此之外，在实验中多加实践，有助于提高实验效果。上海通蔚实业有限公司拥有15年以上的ELISA试剂盒生产经验，搭建了ELISA试剂盒开发和成熟抗原-抗体系统的良好平台。可提供4000多种ELISA试剂盒，主要采用夹心法和竞争法，覆盖3000个靶标，涉及小鼠、大鼠、牛、兔、猪等20多个种类。如需试剂盒，欢迎前来咨询！