ELISA是一种广泛应用于生物标志物检测和验证的免疫测定法。它基于抗原抗体反应原理，将抗原或抗体固定在固相载体上，通过酶联标记的抗体或抗原与目标物质发生反应，再用酶的底物显色，根据颜色的深浅来定量检测目标物质。ELISA技术具有灵敏度高、操作简便、成本低、可自动化等优势，使其在研究和临床环境中得到了广泛应用。
ELISA技术已在研究和临床环境中使用了40多年，能够以简单的方式量化数千种生物标志物，在疾病诊断、药物开发、食品安全、环境监测等领域发挥着重要的作用。如今，每天都有新的ELISA被开发出来，用于检测新的生物标志物或用于新的物种。例如，在疾病诊断领域，ELISA可以用于检测血液、尿液等样本中的生物标志物，用于疾病诊断、疾病发展监测和治疗效果评估。在药物开发领域，ELISA可以用于筛选和验证药物靶点，检测药物的药效和安全性，进行药物代谢研究。此外，ELISA技术也广泛应用于食品安全检测和环境监测，例如检测食品中的残留农药、兽药、重金属等污染物，以及检测水、土壤、空气等环境中的污染物。
随着技术的不断发展，ELISA技术也得到了不断改进，例如高通量ELISA技术的应用，可以同时检测多种生物标志物，提高效率。纳米材料的应用，可以提高ELISA的灵敏度和特异性。微流控芯片技术的应用，可以实现ELISA的自动化和小型化。
从技术角度来看，ELISA有几种类型，取决于它们是基于双重（或夹心）抗体检测、直接检测、竞争性检测等。本文不打算详细介绍ELISA的不同检测方法，如果想了解可以参考之前的相关文章。本文，针对自己多年ELISA实验经验心得总结一些提高ELISA实验成功技巧，在日后实验中可以帮助您提高实验的效果！
实验前的准备
在进行实验前，选择一款合适试剂盒非常重要，试剂盒选择应该具备特异性好、灵敏度高、稳定性好、操作方便。下文将详细说明。
样本的收集和保存
决定ELISA成功关键与否，ELISA样本收集和保存非常重要。即使再好的ELISA试剂盒，如果样本污染或者制备不当都有可能造成检测结果不准。
试剂存储
所有试剂都应按照建议的温度储存。如果您打算分几轮使用ELISA试剂盒，请务必事先计算好用量并进行分装，以避免反复冻融。冻融循环会对标准品、检测抗体等试剂的活性产生极大的负面影响。这是因为反复冻融会导致蛋白质变性，降低抗体与抗原的结合效率，进而影响实验结果的准确性。此外，冻融过程中形成的冰晶也会破坏试剂的结构，降低其稳定性和有效性。
同样地，冷冻/解冻也会对样品本身产生负面影响，特别是对温度敏感的细胞裂解液或血清样品。应尽量避免反复冻融任何生物样品。适用于冰箱中食物储存的方法也适用于生物试剂和样品：尽量减少不必要的冻融循环。如果需要长期保存样品，可以考虑-80℃保存或液氮保存等更稳定的方法。
标准品准备
在ELISA实验中，正确准备标准品至关重要。首先，在打开标准品瓶盖之前，务必将小瓶彻底旋转，确保粉末完全沉淀到瓶底，避免任何残留在瓶盖上，影响最终的浓度。
配制时，要将测定稀释剂加入小瓶后，将试管上下颠倒几次，然后轻弹试管底部数次，使液体充分混合。重复此过程5-6次，或直至粉末完全溶解。切勿使用涡旋振荡器混合，因为剧烈震荡产生的剪切力可能会导致蛋白质变性，从而影响标准品的活性。
此外，在制备标准品稀释液的过程中，建议将试管置于0-4°C 冰水混合物中，以最大程度地减缓蛋白质降解。但请注意，ELISA实验本身需要在室温下进行。使用后的工作标准稀释液应立即丢弃，因为其在室温下容易降解，不建议保存和重复使用。
光敏试剂的注意事项
ELISA试剂盒中的某些试剂对光线非常敏感，例如常用的显色底物TMB溶液。这是因为TMB在光照下容易分解，导致显色反应减弱，从而影响最终的检测信号，降低结果的准确性。
因此，务必将这类试剂存放在避光环境中，例如棕色瓶或用铝箔包裹的容器内。此外，强烈建议在避光环境下进行显色反应，例如将ELISA板放在避光的抽屉或覆盖遮光布。虽然这不是强制性的，但这样做有助于获得更清晰、稳定的显色信号，避免出现低OD值，提高实验结果的可靠性。
除了TMB溶液，一些荧光标记的抗体也对光线敏感，需要采取类似的避光措施。在进行ELISA实验时，务必仔细阅读试剂说明书，了解每种试剂的特性和正确的操作方法。
ELISA试剂盒选择
在进行ELISA实验时，选择合适的试剂盒至关重要。首先，需要根据您的研究目的和实验设计选择合适的样本类型。
1.样本类型：
血清通常被认为是ELISA的理想样本类型，因为它稳定性高，易于收集。
血浆也是可行的选择，但需要避免使用溶血的样本，因为溶血会增加背景噪音，影响结果的准确性。
尿液也可以使用，但由于回收率较低，可能会降低检测灵敏度。
唾液、支气管肺泡灌洗液(BAL)和脑脊液(CSF)等样本可能存在挑战，因为生物标志物浓度较低，并且可能含有抑制剂。
为了避免浪费珍贵的临床样本，建议您在确定了合适的样本类型和实验方案后，再进行正式实验。
2.试剂盒的选择：
了解您感兴趣的生物标志物在特定实验模型或疾病中的正常水平，这可以通过查阅相关文献和数据库(例如PubMed、NCBI)来实现。
选择标准曲线线性范围包含目标浓度的试剂盒。
除了检测范围，还要考虑试剂盒的灵敏度、特异性和批次间差异等因素。
3.实验结果分析：
如果使用了正确的试剂盒和检测范围，但仍未检测到生物标志物，则可能意味着样本中确实不存在该生物标志物。
4.试用程序：
如果您对选择试剂盒存在疑虑，或者需要进行初步测试，建议使用试用程序。许多试剂盒供应商提供试用程序，您可以在少量样本上测试试剂盒的性能，以便做出更明智的选择。
寻求他人帮助
如果您按照所有操作步骤进行，但ELISA试剂盒仍然出现问题，例如OD值过低、实验结果不稳定、出现假阳性或假阴性结果，可以尝试以下几种方法来改善结果：
1.延长孵育时间:如果怀疑是抗体与抗原的结合效率较低导致OD值过低，可以尝试将孵育时间延长至4°C过夜。这可能有助于提高抗体与抗原的结合，从而增加信号强度。
2.提高HRP浓度:如果怀疑是显色反应不够强烈导致OD值过低，可以尝试将HRP浓度提高1.5-2倍。提高HRP浓度可以增强显色反应，提高OD值，但需要注意，提高HRP浓度也可能增加背景噪音。
3.延长显色时间:如果怀疑是显色时间不够长导致OD值过低，可以尝试延长显色时间。但需要注意，延长显色时间也可能导致背景噪音增加。
4.更换读板器:如果怀疑是读板器的问题导致OD值偏低，可以尝试更换读板器进行测试。
5.验证HRP和TMB:如果怀疑HRP或TMB出现问题，可以将一些HRP(2-5μL)加入干净的试管中，添加一些TMB(5μL)，观察是否有蓝色变化。如果颜色很淡，则可能需要联系试剂盒制造商寻求帮助。
6.咨询试剂盒制造商:如果尝试以上方法仍然无法解决问题，建议您联系试剂盒制造商寻求帮助。他们可能提供更专业的建议和技术支持。
在尝试以上解决方案时，请务必记录实验条件，并注意不要改变实验的整体方案，以方便分析结果。
上述内容是从实验细节上为大家剖析了遇到一些问题，整理的比较凌乱，大家仅供参考，可以说是为大家提供一个解决问题思路。实验的成功与否，关键在于细节操作和注意事项，大家严格按照说明书及实操积累的经验完全可以应对实验，提高实验的成功率！不管是新手还是老手，大胆实验，大胆总结。
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