ELISA是什么检测方法？带您深入了解ELISA

  ELISA（酶联免疫吸附测定）是实验室中使用的一种免疫测定方法，用于检测和定量血清或血液样本的复杂混合物中的可溶性物质，例如肽、蛋白质和抗体。该测定也称为酶免疫测定（EIA）。
  
  在此测定中，抗原或抗体被固定在 ELISA 板的表面，分析物在板中孵育以与靶标结合。然后通过提供特定的生理条件来洗脱抗原-抗体复合物。
  
  ELISA检测的整个过程可分为三个阶段：
  
  1、包被/捕获：将特异性抗原固定在96孔板的表面。通常捕获抗体被固定在表面上以捕获目标抗原。
  
  2、板封闭：为了避免背景信号并确保目标抗原和特异性抗体之间的有效结合，板的剩余表面用一些蛋白质覆盖。
  
  3、探测/检测：将含有反应混合物的 ELISA 板与与目标抗原结合的抗原特异性抗体一起孵育。酶联检测抗体用于产生显示测试样品中存在的抗原/分析物量的信号。
  
  ELISA测定中使用的检测抗体是传统的单克隆抗体、多克隆抗体或重组单克隆抗体。此外，在测定过程中要确保的一件事是捕获抗体和检测抗体都必须识别不重叠的表位。
  
  ELISA 方案中经常涉及的酶缀合物包括 β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶 (AP)、辣根过氧化物酶 (HRP) 和过氧化氢酶。它们与特定的底物结合以产生可检测的信号范围。
  
  4、信号测量：使用读板机读取目标抗原和抗体之间反应产生的信号量。获得的数据可以是定量的、半定量的和定性的。在定量研究中，浓度结果根据标准曲线绘制，该曲线将光密度与对数浓度进行比较。
  
  在本文中，上海通蔚生物将介绍四种常见类型的 ELISA 方法以及免疫学实验室中用于一系列研究应用的检测技术。
  

  ELISA 有哪些类型？

  
  ELISA检测主要有四种类型：
  
  1. 直接 ELISA
  
  直接 ELISA 技术涉及将抗原固定在聚苯乙烯微孔板上，然后使用蛋白质（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA 或任何其他动物蛋白）封闭微孔板。然后，洗涤板并与一抗一起孵育。
  

  在此测定中，一抗直接与底物（例如 HRP 或 AP）结合，导致颜色变化。由于过程中只涉及较少的步骤，直接 ELISA 是一种适用于实验室工作流程的快速技术，同时还消除了二抗交叉反应。但其缺点是反应灵敏度低、成本低。

  
  
  2. 间接 ELISA
  
  该技术的步骤与直接 ELISA 类似。唯一的区别是涉及额外的洗涤步骤以及该过程中使用的抗体类型。
  
  间接 ELISA工作流程中  涉及两种类型的抗体：一抗和二抗。
  
  首先添加一抗并洗涤，然后与标记的二抗一起孵育。
  

  间接 ELISA 的优点是成本较低、更加灵敏和灵活。然而，由于二抗的存在，检测过程中存在交叉反应的可能性。

图：间接 ELISA 涉及的步骤

  
  3. 三明治 ELISA
  
  在此测定中，抗原夹在两种抗体之间。这就是该测定被称为夹心 ELISA 的原因。该测定首先使用捕获抗体包被微孔板表面，用 BSA 封闭表面，然后向微孔板中添加抗原，持续约 90 分钟。
  
  孵育步骤后，用缓冲液清洗板，然后与标记的二抗一起孵育。然后，添加底物来研究和测量反应信号。
  

  尽管夹心 ELISA 具有最高的灵敏度，但其主要缺点是该过程所需的时间和费用。此外，寻找完美抗原抗体对的必要性也是该测定的限制。

  
  4. 竞争性 ELISA
  
  该测定检测测试样品中抗原特异性抗体的存在。它涉及使用两种抗体：样品中存在的抗体和酶联抗体。它们在反应过程中竞争抗原。没有颜色代表阳性测试结果，而有颜色则代表阴性测试结果。
  

  该测定法不能用于经过任何程度稀释的样品，并且灵敏度较低。然而，它有许多优点，例如需要较少的样品纯化、较小的变异性以及分析样品中的一系列抗原。

图：竞争 ELISA 涉及的步骤说明

  

  常用的ELISA检测方法有哪些？

  
  在 ELISA 中，经常使用与特定抗原结合的标记抗体。因此，当将能够转化酶的底物添加到反应混合物中时，会引起溶液颜色的变化。使用检测方法来检测或分析信号。
  
  根据酶和底物的不同，ELISA 检测中的检测方法差异很大。如今，还有许多 ELISA 试剂盒可让您轻松进行 ELISA 测定。但是，它不包含执行检测所需的通用试剂，例如 tween-20、磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、封闭缓冲液、洗涤缓冲液等。
  
  目前有许多检测方法可用于研究抗原抗体复合物之间的反应，例如比色法、荧光法、化学发光法和显色法。然而，下面介绍了其中最常见的三种。
  
  1、化学发光分析
  
  该技术利用过氧化物酶偶联的检测抗体，例如 HRP 和 AP。基于鲁米诺的溶液用作形成反应产物的底物，发射光子，可以使用光度计读取光子。
  
  与其他检测方法相比，该技术具有超灵敏性，具有更宽的动态范围，甚至可以检测给定样品中最少量的分析物。
  
  2、显色测定
  
  显色法是ELISA检测方法中最常见的类型之一。它涉及使用辣根过氧化物酶 (HRP-) 或碱性磷酸酶 (AP-) 标记的抗体与显色底物（例如四甲基联苯胺 (TMB) 溶液）结合使用。
  
  该技术利用反应的吸光度来确定读数，用于比较样品或根据标准曲线检测感兴趣分子的浓度。
  
  3、荧光分析
  
  该技术将过氧化物酶偶联的检测抗体（例如 HRP 和 AP）与暴露于某些光波长时发出荧光的荧光底物相结合。即使分析物浓度较高，信号也不会饱和，并提供更准确的结果。
  
  总的来说，Elisa是一种灵敏、特异、快速的检测方法，广泛应用于生物科学、医学和食品安全等领域。尽管Elisa具有许多优点，但也存在一些限制，例如对于某些特定的检测目标，可能存在交叉反应或假阳性结果。因此，在实际应用中，应根据具体需求和目标选择适当的检测方法，并对其进行合理评估和优化。随着科技的不断发展，Elisa技术也将不断完善和进步，为人类的生活和科学研究提供更多帮助。