ELISA，一种酶联免疫吸附测定法，是一种基于分析板的生化免疫测定法。它广泛应用于生命科学和生物化学实验室，用于生物分子的定量，例如蛋白质、抗体、肽、糖蛋白和激素。
该技术利用抗原和抗体之间的相互作用来产生可测量的结果。抗原是一种启动免疫反应的外来蛋白质，其中可能包括与抗体复合后的一系列反应。抗体是生物体免疫系统产生的蛋白质。ELISA测定中涉及的两种抗体是一抗和二抗。关于抗原和抗体可以参考《免疫学检测：一抗和二抗简介》
在该技术中，抗原被固定在ELISA板的表面，然后与酶缀合物抗原特异性抗体一起孵育。这导致抗原-抗体复合物的形成。然后使用特定底物和合适的检测方法，通过孵育含有抗原-抗体复合物的ELISA板来检测反应产物。
在实验室遵循的通用ELISA方案包括以下步骤：
1、抗原固定在ELISA板的表面。
2、使用封闭缓冲液覆盖板的其余部分。
3、ELISA板与抗原在室温下孵育抗原特异性抗体。
4、使用读板器测量反应产物或获得的信号。
ELISA的最后一步是将含有反应混合物的ELISA板与合适的底物一起孵育。底物的使用取决于您使用的检测方法，并与抗体酶联，例如辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶(AP)。这有助于信号放大和板中发生的反应的可视化。
ELISA应用中常用的一些底物是过氧化氢、鲁米诺和对硝基苯磷酸盐（pNPP底物）。
在本文中，上海通蔚生物将介绍这些底物在ELISA测定过程中的工作原理、它们的功能以及它们在不同医疗和生物技术实验室和行业中的应用。
ELISA底物如何工作？
ELISA底物通过与缀合的酶结合来检测测定中使用的抗体。该酶将底物转化为有色产物或荧光或电化学信号，使用分光光度计、分光荧光计或电化学装置获取其吸光度或读数，以定量给定样品中的抗原。
不同的底物在与酶的氧化反应过程中产生不同的颜色。例如，辣根过氧化物酶底物与HRP酶反应后产生以下结果：
1、ABTS（2,2′-Azinobis[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐）：绿色
2、TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯胺）：橙色
3、OPD（邻苯二胺）：蓝色
产生的颜色量或获得的信号量与与固定在96孔板表面的抗原结合的一抗的量成正比。
图：HRP酶与其底物之间抗原抗体复合物形成和氧化反应的图示
获得高质量、一致、可靠的蛋白质测量结果。如今，研究人员使用ELISA试剂盒。这些检测试剂盒配备了运行特定ELISA检测所需的所有合适试剂。它们执行起来既简单又快捷。此外，它们具有最低的测定间和测定内变异性、高灵敏度和最高可能的批次间一致性。
市场上还有一些底物试剂盒，配有适合ELISA检测步骤的酶-底物试剂配方。它们使这个过程更快更容易。
ELISA底物类型
根据所使用的检测方法，ELISA底物分为以下几类：
化学发光底物
报告酶-底物反应中产生的光用作化学发光检测系统的信号。用于HRP酶的化学发光底物溶液包括鲁米诺。AP酶需要基于1,2-二氧杂环丁烷的试剂来产生X射线胶片或电荷耦合器件(CCD)相机捕获的信号。
为了提高化学发光信号的强度、持续时间和灵敏度，检测过程中还使用了增强化学发光底物(ECL)。然而，应稀释底物以防止错误的高强度信号。
显色底物
这些底物与报告酶反应产生有色的不溶性反应产物，并使用分光光度计进行检测。该方法中使用的HRP底物包括2'-嗪双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)；5-氨基水杨酸（5-AS）；3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)；和邻苯二胺（OPD）。
AP酶的底物是5-溴-4-氯吲哚基磷酸盐(BCIP)和硝基蓝四唑(NBT)。通过使用终止溶液可以增强所得的比色信号，以获得更准确的信号测量。
图：显色检测方法的机制说明
荧光底物
荧光ELISA底物需要荧光计能够产生正确的激发光束，以便荧光标签发出信号。荧光计通过其激发和发射滤光片测量信号。
ELISA测定中使用的荧光AP底物是4-MUP（4-甲基伞形磷酸酯），它在440 nm的发射波长和360 nm的激发波长处产生信号。HPPA（3-对羟基苯基丙酸）和HPA（羟基苯基乙酸）底物与过氧化物酶配对。
图：荧光检测机制的图示。
为您的ELISA测定选择合适的底物取决于灵敏度（较低或较高的检测限）、时间要求以及过程中需要/使用的检测设备的类型。
ELISA底物有何用途？
ELISA底物对于ELISA测定中获得的信号的检测、放大和定量至关重要。它们与酶发生反应，产生有色产物或信号，并使用合适的设备进行测量。
ELISA检测
ELISA是一种用于识别和定量生物分子（例如蛋白质、肽、糖蛋白和激素）的生化测定法。ELISA的最后一步是对含有抗原抗体（与荧光团或酶结合）复合物的反应混合物以及用于反应可视化的合适底物进行孵育的ELISA板。
底物与HRP或AP酶反应，产生不溶性有色反应产物或信号，由仪器、分光光度计或分光荧光计进行测量。
哪些行业使用ELISA底物？
HRP和AP是两种最常用的酶，用于在ELISA检测中结合抗体来检测抗原。这主要是因为它们的简单性和高灵敏度。
在测定中，它们与合适的底物发生反应，产生用于抗原分析的可测量信号。因此，ELISA底物是ELISA方案的关键组成部分之一，并用于许多不同的实验室和行业。
制药
制药行业使用ELISA测试来检测多种疾病，例如流感、艾滋病毒、登革热和莱姆病。市场上还有一些ELISA试剂盒，可以使工作流程更快、更轻松。
此外，ELISA测定在疫苗开发中也至关重要。它们检测针对故意注射到宿主体内的抗原而形成的抗体。
食品工业
在食品工业中，ELISA检测用于检测制成品中的食品过敏原，特别是涉及牛奶、杏仁、花生、核桃和鸡蛋。它可以防止食品中的欺诈性替代品并证明其在市场上的真实性。
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