细胞培养：如何培养骨髓巨噬细胞

  巨噬细胞是适应性免疫系统的关键细胞，与许多疾病有关。可以使用巨噬细胞样细胞系（如小鼠RAW264.7系）在体外研究它们。然而，细胞系是永生化的，通常不能反映细胞的典型功能。可以从小鼠骨髓中提取和培养原代巨噬细胞，并将其分化为骨髓衍生巨噬细胞(BMDM)。BMDM代表了巨噬细胞功能的更准确模型。由于原代细胞可能难以处理，我们整理了一些实验技巧。

  以下是成功提取和培养BMDM的技巧：

  1.保持清洁。在切割骨头边缘之前，去除所有组织并用70%乙醇彻底清洁骨头，以避免骨髓受到污染。骨头的外部不是无菌的，这可能会污染下游培养物。还建议用青霉素/链霉素补充骨髓培养基，以进一步降低污染风险。如果可能，请在无菌环境中进行提取。骨头外部的细胞最终可能会进入骨髓提取物中并长出巨噬细胞前体。

  2.制作单细胞悬浮液。使用针头和注射器分离细胞团块。骨髓可能会以大细胞团块的形式被冲洗出来，但可以用针头上下冲洗来分解这些细胞团块，以制作单细胞悬浮液。一旦去除细胞团块，还应使用70uM细胞过滤器过滤细胞悬浮液以去除骨碎片。

  3.从骨髓中裂解红细胞。这将浓缩您的样本中的巨噬细胞前体并增加您的BMDM产量。

  4.细胞密度很重要。在进行分化之前，使用传统血球计数器和显微镜对骨髓细胞进行计数和检查其活力。骨髓细胞非常小，自动细胞计数器可能无法准确计数细胞浓度。骨髓细胞对其细胞密度很敏感：目标是1x10 6个细胞/毫升。

  5.使用合适的塑料。在非组织培养涂层塑料（无菌细菌培养皿）上分化巨噬细胞。否则它们会变得过于粘附，您可能无法将它们拆下重新接种用于实验。

  6.坚持严格的细胞喂养。BMDM培养基必须含有巨噬细胞集落刺激因子( M-CSF )–可以使用重组形式的蛋白质(10ng/mL)或来自自然分泌该蛋白质的鼠成纤维细胞L929的条件培养基(培养基的20%v/v)。提取后第4天，向培养物中添加等量的新鲜培养基，从而使培养基体积加倍。逐滴添加以免扰乱细胞。提取后第7天，巨噬细胞将分化，现在可以分离并重新接种用于实验。此后必须每48小时更新50%的培养基以保持细胞活力。不要完全更换培养基，因为原代细胞对其分泌的自分泌因子很敏感。

  7.不要干扰早期培养。虽然在提取后的几天内检查细胞可能很诱人，但在前4天内不要触摸培养皿，以让细胞附着。

8. 时机很重要。BMDM将在提取后7天分化。实验（包括巨噬细胞极化（如果需要））应从此时开始，持续时间不超过一周。此后，细胞可能不再代表巨噬细胞表型和基因型。

上述通蔚为大家介绍了如何培养骨髓巨噬细胞及成功提取和培养BMDM的技巧。希望上述内容对您培养巨噬细胞有所帮助。