抗体检测知多少？这些方法你都知道吗？

抗体是各种实验室技术的强大研究工具。在这里，上海通蔚给大家介绍一些检测抗体的常用方法，这些方法包括酶联免疫吸附测定 (ELISA)、酶联免疫斑点 (ELISPOT)、蛋白质印迹 (WB)、免疫沉淀 (IP) 和染色质免疫沉淀 (ChIP)、免疫组织化学 (IHC)、免疫细胞化学（ICC）、流式细胞仪和 FACS。

内容

1. 酶联免疫吸附测定 (ELISA)

2. 酶联免疫斑点 (ELISPOT)

3. 蛋白质印迹 (WB)

4. 免疫沉淀 (IP) 和染色质免疫沉淀 (ChIP)

5. 免疫组织化学 (IHC)

6. 免疫细胞化学（ICC）

7. 流式细胞仪和FACS

  酶联免疫吸附测定 (ELISA)

  ELISA 是一种基于板的技术，能够检测生物样品中的抗原。与其他免疫测定一样，ELISA 依靠抗体利用高度特异性的抗体-抗原相互作用来检测目标抗原。ELISA 能够对分析物和分子相互作用进行定量和表征。

  在 ELISA 中，抗原直接固定在固体表面上，或者更常见的是通过捕获抗体固定在固体表面上，捕获抗体本身也固定在表面上（图 1）。清洗表面，然后与与酶或荧光团等分子缀合的检测抗体一起孵育。

  在抗原存在的情况下，这些检测抗体将保持与板结合，从而提供信号。该信号的强度对应于样品内的抗原浓度。

  图 1.夹心 ELISA 设置。多孔板上的捕获抗体将固定感兴趣的抗原。该抗原将被与生物素和链霉亲和素-HRP 缀合的检测抗体识别并结合。

  ELISA 通常在多孔板（96 或 384 孔）中进行，分析物的固定有助于将抗原与其余样品成分分离。这些特性使 ELISA 成为同时对多个样品进行的最简单的检测方法之一。

  ELISA 有四种主要类型：直接法、间接法、夹心法和竞争法，每种类型都有独特的优点、缺点和适用性。每个实验最合适的 ELISA 形式取决于许多因素，包括所需的灵敏度、特异性和测定时间。详细了解，请点击elisa的类型。

  酶联免疫斑点 (ELISPOT)

  酶联免疫斑点 (ELISPOT) 用于检测细胞分泌的蛋白质，例如细胞因子和生长因子。该技术能够量化和比较对各种刺激的免疫反应。

  细胞在带有抗体包被的 PVDF 或硝酸纤维素膜的 96 孔板中生长。使用一抗和缀合二抗检测感兴趣的分泌蛋白。分泌感兴趣蛋白质的细胞将显示为彩色或荧光点。对膜进行扫描和分析，以量化分泌蛋白质的细胞的数量或比例。

  蛋白质印迹 (WB)

  蛋白质印迹广泛用于分离和鉴定蛋白质的研究中。蛋白质印迹使我们能够检测蛋白质，确定样品之间的相对蛋白质水平，并确定目标的分子量，从而深入了解其翻译后处理。

  蛋白质印迹涉及三个主要步骤：(1) 按大小分离蛋白质，(2) 将蛋白质转移到膜上，以及 (3) 使用一抗和二抗可视化目标蛋白。

  第一步，将蛋白质加载到凝胶上，并通过凝胶电泳根据大小进行分离。然后利用电流将蛋白质条带迁移到膜上。蛋白质转移到膜上是必不可少的，因为用于电泳的凝胶为随后的免疫染色提供了较差的表面，即抗体不会粘附到凝胶的蛋白质上。

  最后，膜可以用感兴趣目标的特异性抗体进一步进行免疫染色，并使用二抗和检测试剂进行可视化。

  免疫沉淀 (IP) 和染色质免疫沉淀 (ChIP)

  免疫沉淀 (IP) 是一种分离和纯化单个蛋白质和复合蛋白质的多功能技术。在该技术中，抗体被固定在固相基质（例如磁珠/琼脂糖珠）上，从复杂溶液中捕获抗原。

  染色质免疫沉淀 (ChIP) 用于确定给定蛋白质是否在体内与特定 DNA 序列结合。ChIP 使研究人员能够识别整个基因组中感兴趣的蛋白质结合的特定基因和序列，从而为其调控功能和机制提供关键线索。

  ChIP 程序（图 3）利用抗体对感兴趣的蛋白质（例如转录因子）及其相关 DNA 进行免疫沉淀。然后回收相关的 DNA，并通过 PCR、微阵列或测序进行分析，以确定基因组序列和蛋白质结合的位置。

  免疫组织化学 (IHC)

  免疫组织化学 (IHC) 是一种利用抗体-抗原相互作用来了解组织切片中抗原的分布和定位的方法。尽管 IHC 的定量程度低于蛋白质印迹或 ELISA，但它具有在完整组织中表征蛋白质表达的优势。

  IHC 通常用于诊断癌症等疾病中的组织异常。IHC 提供了宝贵的观点和支持，可以将从其他方法获得的数据结合起来。

  IHC 染色依赖于识别目标抗原的抗体。您可以使用显色或基于荧光的检测系统来可视化这种抗体-抗原相互作用。在显色检测中，抗体与酶结合，当暴露于显色剂时会产生有色沉淀。在荧光检测中，抗体与荧光团缀合。样品制备和可视化有多种技术，所使用的方法应根据您的标本类型和所需的灵敏度程度进行定制。

  免疫细胞化学（ICC）

  免疫细胞化学 (ICC) 用于使用标记抗体研究蛋白质的亚细胞分布。与 IHC 不同，该技术侧重于细胞样本而不是组织块。

  在 ICC 染色中，针对目标蛋白质产生的抗体应用于已固定和透化的细胞培养样品。ICC 有两种类型：直接和间接。直接 ICC 使用偶联的一抗，而间接 ICC 涉及未偶联的一抗，然后通过偶联的二抗进行检测。对于大多数 ICC 实验，抗体都用荧光团标记，这对于共定位研究来说是理想的选择。各种成像技术，例如宽场、共焦或旋转圆盘显微镜，可用于检测信号。

  流式细胞仪和 FACS

  流式细胞术是一种流行的基于激光的技术，用于分析细胞或颗粒的特征。该技术测量与混合群体中单个细胞结合的标记抗体发出的荧光。此外，不同细胞对光的散射可用于确定它们的大小和特性。

  流式细胞术使您能够分析细胞表面和细胞内分子的表达，表征和定义异质细胞群中的不同细胞类型，评估分离亚群的纯度，并分析细胞大小和体积。它允许同时对单细胞进行多参数分析。

  荧光激活细胞分选 (FACS) 是流式细胞术的衍生技术，可根据荧光标记将细胞群物理分离成亚群。