间接ELISA实验原理及步骤

间接ELISA是一种常用的酶联免疫吸附试验，用于检测特定抗体，例如在感染性疾病诊断中检测针对特定病原体的抗体。它通过使用二抗来放大信号，从而提高检测的灵敏度。下面，我们将详细介绍间接ELISA的原理和步骤。

间接ELISA原理

将纯化的抗原包被在微孔板上。然后，加入待测样本（例如血清），如果样本中存在针对该抗原的特异性抗体（一抗），则一抗会与抗原结合。洗去未结合的一抗，以去除背景信号。接下来，加入针对一抗物种的酶标二抗，二抗会与结合在抗原上的一抗特异性结合。再次洗涤以去除未结合的二抗。最后，加入酶的底物，底物被酶催化产生可检测的信号，例如颜色变化。通过测量信号的强度，可以定量或定性检测样本中目标抗体的含量。

间接ELISA步骤

步骤一：将已知抗原溶液加入到酶标板孔中，在 37°C 孵育 1-2 小时，或室温孵育 2-4 小时，使抗原吸附到酶标板底部。最佳的孵育时间和温度取决于所使用的抗原，可以参考自己试剂盒说明书进行孵育。

步骤二：包被后，用洗涤液（例如 PBS-Tween 20）洗涤酶标板 3-5 次，以去除未结合的抗原，用封闭缓冲液（如BSA或脱脂奶粉溶液）填充所有孔，封闭未结合的点，以防止非特异性结合。封闭步骤有助于减少背景信号，通常在室温下孵育30分钟至2小时或4℃过夜（孵育时间可以参考说明书），封闭后，再次用洗涤液洗涤酶标板 3-5 次，以去除多余的封闭液。

步骤三：封闭结束后，将待测样本（如血清、细胞培养上清等）用合适的稀释液（例如 PBS-Tween 20）进行稀释。将稀释后的样本加入到相应的孔中，同时设置阳性对照和阴性对照。在 37°C 孵育 1-2 小时，或室温孵育 2-4 小时，使抗体与包被的抗原充分结合。孵育结束后，用洗涤液（例如 PBS-Tween 20）洗涤酶标板 3-5 次，以去除未结合的抗体。

步骤四：完成样本孵育后，用洗涤液（例如 PBS-Tween 20）洗涤酶标板 3-5 次，以去除未结合的抗体和其他样本成分。洗涤时，将洗涤液注满每个孔，静置 1-2 分钟后彻底倒掉，并轻拍酶标板边缘以去除残留液体。重复此步骤 3-5 次，或根据实际情况调整洗涤次数。也可以使用洗板机进行洗涤。

步骤五、加入针对样本中抗体（例如人IgG）的酶标记的二抗，该二抗需特异性识别一抗的物种来源（例如兔）。例如，如果一抗是兔来源的抗体，则需要使用针对兔IgG的酶标二抗。二抗会与结合在抗原上的一抗结合。在 37°C 孵育 1-2 小时，或室温孵育 2-4 小时。孵育结束后，用洗涤液（例如 PBS-Tween 20）洗涤酶标板 3-5 次，以去除未结合的酶标二抗。

步骤六：加入合适的底物溶液（如TMB或OPD），酶标二抗中的酶会催化底物产生颜色变化。颜色的深浅与样本中抗体的量成正比。在颜色达到合适的深度后，加入终止液（例如硫酸或盐酸）来停止显色反应。使用酶标仪在特定波长下（例如，TMB为450 nm）读取吸光度值。最后，根据吸光度值，结合标准曲线或其他方法，可以定量或定性分析样本中抗体的含量。

  以上就是间接ELISA的基本原理和步骤。理解这些原理和步骤对于成功进行间接ELISA实验至关重要。间接ELISA是一种用途广泛的技术，可用于检测各种抗体，并在传染病诊断、免疫研究等领域具有广泛的应用价值。