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PCR、RT-PCR 和 qPCR:哪种技术是你的科研助手?

发布时间:2024-04-26     发布作者:上海通蔚生物

  聚合酶链式反应(PCR)是一种相对简单且广泛使用的分子生物学技术,用于扩增和检测DNARNA序列。与传统的DNA克隆和扩增方法相比,PCR只需要数小时,具有快速、高效和特异性强。因为实验需求,目前在PCR基础上改进。大家在实验中还接触到了RT-PCRqPCR。今天,上海通蔚给大家来介绍一下它们之间的区别。


  PCR


  聚合酶链反应,也就是PCRpolymerasechainreaction)技术,这是一种使用DNA聚合酶拷贝选定DNA区域的技术,由KaryMullis及同事在20世纪80年代发明,KaryMullis也因此被授予了诺贝尔化学奖。PCR常用于基因克隆、基因分析、基因诊断、DNA指纹识别等领域。


  PCR实验前需要 DNA聚合酶、镁、核苷酸、引物、待扩增的DNA模板和热循环仪。PCR由三个步骤组成:变性-退火-延伸。


  模版DNA变性:双链DNA经加热至93℃左右一定时间后,使其解离使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;


  模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结;


  引物的延伸:DNA模板-引物结合物在72℃DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。经过一系列温度和时间的变性、退火和延伸过程称为一个扩增循环。循环的每个步骤都应针对所使用的模板和引物组进行优化。该循环重复大约20-40次,然后通常通过琼脂糖凝胶分析扩增产物。



图1 PCR扩增示意图


  RT-PCR


  逆转录PCRreversetranscription PCR)或者称反转录PCRreversetranscription-PCR,RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。RT-PCR灵敏度高,操作简单,常用于基因表达分析、病毒检测、RNA 病毒的定量等领域等。


  RT-PCRPCR区别在于它是从mRNA模版开始,在逆转录酶的催化下,随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementaryDNAcDNA),按照普通PCR的方法用两条引物以cDNA为模板,则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。


图2 逆转录RT-PCR原理图


  qPCR


  qPCR实时定量PCRreal-timePCR)是是一种在DNA扩增时(即实时)对其定量的方法,常用于基因表达定量、病原体检测、基因分型。与普通PCR一样,DNA通过三个重复步骤进行扩增:变性、退火和延伸。在qPCR中,荧光标记可以随着PCR的进展收集数据。由于可用的方法和化学物质范围广泛,该技术具有许多优点。在基于染料的qPCR(通常为绿色)中,荧光标记允许通过使用dsDNA结合染料对扩增的DNA分子进行定量。在每个循环期间,测量荧光。荧光信号随复制DNA的数量成比例增加。


图3 qPCR实时定量原理图


  上述为大家介绍了PCRRT-PCRqPCR区别,选择哪种技术取决于实验目的和需求。 如果只需要确定是否存在特定 DNA RNA 序列,可以选择 PCR RT-PCR;如果需要精确量化起始模板的含量,则 qPCR 是更好的选择。关于PCR还有疑问,欢迎前来咨询。上海通蔚有上述三种技术的PCR试剂盒,对PCR试剂盒有需要的欢迎前来咨询,我们PCR试剂盒快速、高效、特异性强。