当科研实验进行蛋白质免疫分析时，良好的信号检测对于研究结果的可重复性至关重要。获得良好免疫测定结果的一种特定方法是选择与一抗相匹配的二抗。
但什么是一抗和二抗呢？它们如何帮助信号检测？在本文中，我们向您简要介绍了免疫分析中信号检测中常用的两种抗体、这些抗体之间的差异，以及有关如何选择一抗和二抗的一些有价值的提示。
在本文中您将了解到：
什么是蛋白质免疫分析？
免疫测定是使用抗体检测实验样品中的蛋白质、测量其浓度并研究细胞或组织样品中的蛋白质功能或定位的方法。
虽然这里有几种严重依赖抗体检测的检测技术，但我们将重点介绍两个例子：酶联免疫吸附测定 (ELISA) 和蛋白质印迹法。
1.酶联免疫吸附测定（ELISA）
在 ELISA 中，抗体（称为一抗）附着在固定在固体表面（例如板中的孔）上的目标蛋白上。二抗与该抗体-靶蛋白复合物结合，有助于检测靶蛋白。这种类型的测定对于检测少量的特定蛋白质非常有用。关于酶联免疫吸附测定，可以参考认识免疫学试验——酶联免疫吸附测定 (ELISA)
2.蛋白质印迹法（WB）
另一种检测靶蛋白的方法是蛋白质印迹法。与 ELISA 类似，目标蛋白固定在固体表面（本例中为膜）上。一抗检测目标蛋白，添加二抗检测目标蛋白。
什么是抗体？
抗体是针对入侵者（例如病毒或细菌）的免疫反应的蛋白质成分。在检测到入侵者身上的外来物质（称为抗原）后，免疫反应会产生针对这些抗原的抗体或免疫球蛋白以中和它们。
抗体由四种多肽组成，具有两条相同的轻链和两条相同的重链。
抗原结合片段或Fab片段是与抗原结合的轻链区域。而片段可结晶区或Fc片段是附着于细胞表面的抗体结构的尾部区域。
根据重链区域，免疫球蛋白可分为以下几类
1、免疫球蛋白 G (IgG)
免疫球蛋白 G 或 IgG 有 4 条链，其中两条相同的 50 kDa γ 重链和 25 kDa κ 或 λ 轻链。IgG 是人血清中最丰富的抗体。根据血清中的丰度，IgG 分为四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4。
2、免疫球蛋白 D (IgD)
免疫球蛋白 D 或 IgD 具有 δ 重链。IgD 存在于未成熟的初始 B 细胞的表面。B 细胞是免疫细胞的一种。
3、免疫球蛋白 E (IgE)
免疫球蛋白 E（或 IgE）具有 ε 重链。IgE 与过敏反应有关。
4、免疫球蛋白 A (IgA)
免疫球蛋白 A 或 IgA 具有 λ 重链。IgA 是一种存在于分泌物中的抗体，例如唾液、眼泪、乳汁、呼吸道和肠道分泌物。
5、免疫球蛋白 M (IgM)
免疫球蛋白 M 或 IgM 具有 µ 重链。IgM 是感染后发育中的 B 细胞产生的第一种抗体。
什么是一抗和二抗？
许多免疫测定中通常使用的两种类型的抗体是一抗和二抗。
一抗：特异性结合抗原的抗体。
二抗：与一抗结合的抗体。
一抗和二抗都可以是单克隆或多克隆抗体。单克隆抗体和多克隆抗体可以参考：《蛋白质免疫测定：认识多克隆抗体和单克隆抗体》
一抗和二抗的主要区别是什么？
一抗和二抗之间的区别主要在于与抗原的结合。
一抗直接与特定抗原结合。在这种情况下，它将是您实验中的目标蛋白质。二抗与一抗结合，而不是与靶抗原结合。
在抗体生产过程中，用于生产一抗的目标抗原和宿主物种与用于生产二抗的目标抗原和宿主物种不同。
一抗和二抗是如何产生的？
初级抗体的产生需要一种宿主物种，例如兔子、小鼠、山羊或鸡。在第一个生产步骤中，宿主将针对抗原进行免疫以产生一抗。
二抗的生产始于将来自一个特定宿主物种的一抗注射到完全不同的宿主物种中。例如，如果产生的抗体来自小鼠，则可以在兔、山羊或鸡中产生二抗。
针对整个抗体或 IgG 产生的二抗可识别所有 IgG 片段。它们识别轻链和重链。它们也相对便宜并且对于许多一般免疫测定有用。
然而，它们可以结合一抗的 Fc 区和细胞上的 Fc 受体。为了提高检测中二抗的特异性并减少交叉反应性，您可以使用针对 Fc 片段、Fab 片段或其他片段生成的特定抗体。
例如，针对 Fab 区的二抗可用于免疫沉淀后的蛋白质印迹。这种类型的抗体仅识别 Fab 片段，因此它们比针对整个 IgG 的抗体更具特异性。因此，使用 Fab 片段特异性抗体可以避免在印迹上检测到大小为 50 kDa 的不需要的重链，从而妨碍了具有相似大小的目标蛋白的可视化。
为了检测靶蛋白，将产生信号的分子附着到一抗或二抗上是必不可少的。
一抗和二抗在免疫测定中如何发挥作用？
您可以使用直接或间接免疫测定来可视化抗原与一抗的结合。
在直接免疫测定中，一抗附着在信号分子上。当一抗与抗原结合时，这种抗原-抗体相互作用会激活信号分子，从而进行检测。
在间接免疫测定中，二抗有助于检测，因为这些抗体与信号分子连接。该方法的工作原理是：二抗识别与抗原结合的一抗，然后该复合物的形成激活信号分子。
二抗如何产生视觉信号？
使用二抗时，您将进行间接免疫测定。此处，二抗与抗原结合的一抗结合。这种相互作用导致附着在二抗上的信号分子发出信号，或将不可检测的底物转化为蛋白质印迹上的视觉信号（Yu et al., 2015）。
以下是信号分子的一些示例：
放射性同位素
可用于间接检测的方法是使用放射性同位素标记的二抗，例如 Iodine-125。这种放射性同位素发射带有低能光子的伽马射线，可以使用 X 射线胶片检测到。
酶
在蛋白质印迹中，通常使用与酶（例如辣根过氧化物）缀合的二抗。添加辣根过氧化物底物后，酶裂解无色底物并在印迹上产生可见的彩色信号。
荧光染料
二抗可以用荧光染料标记，例如异硫氰酸荧光素 (FITC)、R-藻红蛋白、罗丹明和德克萨斯红。抗体的结合会激发特定波长的荧光，并发出另一波长的光。
二抗如何放大信号？
在间接免疫测定中，多个带有信号分子的二抗可以与一抗分子结合。在这种情况下，使用与信号分子结合的二抗可能会导致信号放大（Yu et al ., 2015）。因此，间接检测比直接免疫测定灵敏得多。
如何选择一抗和二抗
了解一抗的详细信息。例如：验证、产生抗体的宿主物种、与免疫测定的兼容性、灵敏度、成本以及对目标蛋白的特异性。
选择与收集样品的宿主物种不同的一抗宿主物种。
确保产生二抗的宿主物种与产生一抗的宿主物种不同。
找到能够识别一抗的二抗。例如，小鼠一抗需要在另一个宿主物种中产生的抗小鼠二抗。
选择与一抗类别或亚类相匹配的二抗。如果单克隆一抗属于小鼠 IgM 类别，则选择抗小鼠 IgM 二抗。当一抗的免疫球蛋白类别或亚类未知时，您可以选择抗小鼠 IgG 二抗。
选择特异性高且与非靶标抗体交叉反应性较小的二抗。
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