5分钟带您了解qpcr及实验步骤

  Pcr(聚合酶链式反应)用于扩增DNA特定片段的聚合酶链式反应技术。在生命科学各个领域（基础研究、生物技术、医学、法医学、诊断学等）都在广泛应用这些方法。常规的PCR主要是定性检测，而实时PCR(QPCR)可以用来定量检测。今天，本文为大家详细介绍下QPCR原理及步骤，为您的实验选择该技术有广泛的了解。

  目录：

  1、什么是QPCR?

  2、QPCR工作原理

  3、QPCR步骤

  4、QPCR应用

5、QPCR常见问题

  什么是QPCR?

  定量聚合酶链式反应(QPCR)与PCR非常相似，在传统PCR中，扩增的DNA产物或扩增子在终点分析中检测。在QPCR中，随着反应的进行，实时测量扩增产物的积累，并在每次循环后对产物进行量化。

  QPCR工作原理

  为了理解QPCR的工作原理，我们使用典型的扩增图来说明qPCR分析（图1）。在该图中，x轴显示PCR循环数，y轴显示扩增反应产生的荧光，该荧光与试管中扩增产物的量成正比。

图 1. 扩增图（基线减去荧光与 PCR 循环数的关系）

  扩增曲线显示两个阶段，一个指数阶段，接着是一个非指数平台期。在指数阶段，PCR产物的量在每个循环中大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应组分被消耗，最终一种或多种组分变得有限。此时，反应减慢并进入平台期（图1中的循环28-40）。

  最初，荧光仍处于背景水平，即使产物呈指数级积累，荧光的增加也是不可检测的（循环1-18，图1）。最终，足够的扩增产物积累以产生可检测的荧光信号。发生这种情况的循环数称为定量循环或C q。由于C q值是在试剂不受限制的指数期测量的，因此可以使用实时qPCR根据描述反应进程的已知指数函数可靠而准确地计算反应中存在的模板的初始量。

  反应的C q主要取决于扩增反应开始时模板的量。如果反应开始时模板量较大，则需要相对较少的扩增循环即可积累足够的产物，从而产生高于背景的荧光信号。因此，反应的C q会较低或较早。相反，如果反应开始时模板量较小，则需要更多扩增循环才能使荧光信号高于背景。因此，反应的C q会较高或较晚。这种关系构成了QPCR定量方面的基础。

  RNA分离

  样本采集

  为了分离RNA并量化基因表达，样本材料应尽可能均匀。如果您的组织样本由多种不同类型的细胞组成，则可能难以确定目标基因的表达模式。如果您的样本不均匀，请使用多种可用于分离和隔离特定细胞类型的方法之一，例如组织解剖、针吸活检和激光捕获显微解剖。然后可以使用收集的细胞来获取RNA样本。

  RNA提取

  总RNA或poly(A+)RNA可用于大多数实时RT-qPCR应用。使用RNA时，一个关键考虑因素是消除溶液、耗材和实验室器具中的RNase。您可以购买即用型无RNase溶液，或者用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理您的溶液，然后进行高压灭菌。实验室器具上的RNase也可以通过DEPC处理或在250°C下烘烤3小时来灭活。

  制备好的RNA样本可能需要DNase处理，以防止任何污染基因组DNA的潜在扩增，这可能导致对mRNA拷贝数的估计过高。然而，当起始材料有限时，DNase处理可能不合适，因为额外的操作可能会导致RNA丢失。可以通过设计转录本特异性引物（例如，跨越或扩增剪接点的引物）来阻止潜在污染基因组DNA的扩增。

  分析核酸数量和质量

  准确的核酸定量对于基因表达分析至关重要，尤其是当使用总RNA量来标准化目标基因表达时。RNA浓度和纯度通常通过测量260nm和280nm处的紫外吸光度比率来确定。

  QPCR步骤

  首先，使用PCR试剂和独特或定制引物设置扩增反应。然后在QPCR仪器中运行反应，并使用专有仪器软件分析收集的数据。

  通过在每个反应孔中加入荧光报告分子，随着产物DNA数量的增加，荧光也会增加，从而实现PCR产物的实时检测。为此使用的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异性引物或探针。配备荧光检测模块的专用热循环仪用于在扩增发生时监测荧光信号。测得的荧光与扩增子的总量成正比；荧光随时间的变化用于计算每个循环中产生的扩增子的数量。

  QPCR相对于PCR的主要优势在于，QPCR可让您在宽动态范围内准确且高灵敏度地确定模板DNA（扩增目标序列）的初始拷贝数。QPCR结果可以是定性的（序列的存在与否），也可以是定量的（拷贝数）。因此，定量QPCR也称为qPCR分析。相比之下，PCR充其量是半定量的。此外，无需凝胶电泳即可评估实时qPCR数据，从而缩短了工作时间并提高了通量。最后，由于实时qPCR反应是在统一的闭管qPCR系统中运行和评估数据的，因此减少了污染的机会，并且在qPCR分析中无需进行扩增后操作。

  qPCR应用

  qPCR用于检测和量化给定样本中的核酸。由于其灵敏度高，分子生物学家最常使用qPCR来测量 基因表达 ，以更好地了解各种疾病和其他生物途径。使用qPCR开发的其他应用包括 下一代测序文库量化、 病原体检测、SNP检测以及microRNA检测和分析。

  带有接头序列的序列在扩增过程中充当模板。使用qPCR的好处是所用材料量最少，并且能够实现自动化。这两种特性都允许执行更多高通量运行。

  温馨提示，qPCR运行产生的数据很大程度上取决于您使用的染料和引物。如果您使用荧光DNA探针代替染料，您将能够使用多重qPCR测量多个DNA目标。

  qPCR常见问题

  什么是多重qPCR

  多重qPCR允许在单个反应中同时检测多个目标DNA（例如来自不同生物体）。我们所有的qPCR检测都包括内部控制引物和探针组，双链体也是如此。其他检测，例如猫呼吸道综合征qPCR检测，可检测两个或更多个目标DNA以及内部控制。

  qPCR检测的敏感性和特异性如何？

  qPCR灵敏度极高，特异性强，能够检测出样本中数量极少的病原体。qPCR的灵敏度使得我们能够通过对混合血清样本或散装牛奶样本进行单次测试来筛查牛群中的BVDV。

  哪些类型的样本适合通过qPCR进行检测？

  qPCR是一种非常通用的技术，可以应用于多种样本类型中DNA或RNA的定量分析。

  什么是内部（扩增）控制？

  内部（扩增）对照(IC)是与病原体核酸同时扩增的目标DNA或RNA。IC可以是宿主基因，也可以是在DNA提取阶段添加到每个样本中的人工DNA/RNA分子。它表明反应中存在可扩增的DNA。在qPCR反应中加入IC有助于识别与特定样本、样本收集、提交或实验室处理相关的假阴性结果。

  什么是阈值循环(ct)值？

  阈值循环(ct)值是PCR产物量（通过荧光测量）达到规定阈值所需的PCR循环数。因此，ct值可以衡量样本中存在的目标DNA量；因此，如果存在的目标DNA量高，则更快达到阈值，从而导致较低的ct值。通常，结果中不包括ct值。

  上文为大家介绍QPCR及步骤，与“传统”或终点PCR检测相比，qPCR（也称为实时PCR）不仅可以提供样本中基因序列的存在与否，还可以提供定量数据——它是高灵敏度、特异性检测和定量分子标记的黄金标准。本文篇幅有限，如果还有关于QPCR问题，欢迎前来咨询！