聚合酶链式反应：数字 PCR

  数字PCR(dPCR)是继终点PCR和实时定量PCR(RT-qPCR)之后的第三代PCR。数字PCR具有高灵敏度、准确性和绝对量化样本中目标DNA量的能力。这种高灵敏度可以检测罕见突变、拷贝数变异(CNV)、低丰度转录本、罕见microRNA和极低病毒载量。

  什么是数字PCR（dPCR）

  数字PCR的概念最早由Sykes等人于1992年提出，他们认识到，极限稀释、终点PCR和泊松统计的组合可以产生核酸浓度的绝对测量值（Sykes等人，1992年）。随后，约翰霍普金斯大学的Vogelstein和Kinzler开发了一种方法，将样本稀释并分配到可以单独扩增单个模板分子的程度，每个分子都在单独的分区中，并使用荧光探针检测产物（Vogelstein和Kinzler，1999年）。“数字PCR”一词就是为描述这种新方法而创造的。

  dPCR与标准终点PCR的不同之处在于，样本首先被随机分成20,0000个子反应，而不是在批量样本上作为单个反应运行。PCR反应在每个分区上进行，可以是单个液滴，也可以是在微流体芯片上。理想情况下，每个分区将包含一个或零个目标序列。为了补偿包含多个目标序列的少数分区，数据通过泊松统计处理。如果分区包含可扩增序列，则将其计为阳性（否则将其计为阴性）。

  假设每个分区只有一个目标，则可以通过计算阳性数并根据分区数和稀释因子进行推断来绝对量化原始样本中有多少个目标。由于计算了实际目标数，因此不需要校准曲线，但建议对已知样本和数量进行控制，以帮助验证数据，尤其是为了发表。

  dPCR是如何工作

  1.样品制备

  与任何基因组分析一样，良好的样品制备至关重要。dPCR可用于扩增任何纯化的DNA样品（gDNA或cDNA），但与qPCR一样，无法直接扩增RNA。因此，在dPCR分析之前，必须分离任何感兴趣的mRNA靶标并将其转化为cDNA。

  然后将纯化的gDNA或cDNA与正向和反向引物以及水解探针混合，每个引物都设计为具有与目标基因/目标DNA互补的序列。与传统PCR一样，引物退火到目标序列的3'和5'端（通常长度为60-150bps）。此外，与传统PCR不同的是，5'核酸酶（水解）探针随后在正向和反向引物之间退火，并包括5'荧光团和3'猝灭剂。水解探针增加了反应的灵敏度。与所有PCR和qPCR一样，引物和探针设计是获得良好数据的关键。

  2.稀释和分配

  在样品制备和添加引物和主混合物后，dPCR检测将样品混合物分成单独的纳升反应，因此每个分区中有1个或0个目标DNA分子。一些dPCR平台将混合物分成单独的微模塑料孔，而其他dPCR平台将纳升大小的反应液滴创建为油/水乳液。然后，dPCR分析大约20,000个单独的qPCR反应。

  3.PCR扩增和终点分析

  分割后，使用常规PCR循环参数扩增反应。随着DNA聚合酶从正向引物延伸，其核酸外切酶活性会降解探针，从3′猝灭剂中释放出5′荧光团，进而发出可检测的荧光。如果检测包括插入染料而不是水解探针，则荧光会随着双链PCR扩增子的积累而增加。

  PCR循环完成后，任何包含一个模板或目标DNA序列的分区都会发出荧光。带有荧光的液滴或孔的总数代表样品中的目标分子总数。实验完成后，可以通过标准工具分析数据。

  数字PCR的应用

  ddPCR系统中的样本分割可实现单个模板分子的灵敏、特异性检测和精确定量，同时减轻靶标竞争的影响，使PCR扩增对抑制的敏感性降低，并大大提高仅相差一个核苷酸的检测的鉴别能力。与其他PCR方法相比，数字PCR具有显著优势：绝对定量和大大增强的灵敏度和动态范围。由于其高灵敏度、精确度和绝对定量，数字PCR在许多应用中将核酸分析的范围扩展到其他方法无法企及的范围：

•   液体活检
•   拷贝数变异(CNV)
•   稀有序列检测
•   基因表达和miRNA分析
•   单细胞分析
•   细胞和基因治疗中的污染物检测
•   病原体检测
•   下一代测序(NGS)文库分析