了解His标签：实验室中的重要工具

  在实验室里或许你或多或少接触过His检测，His也叫“组氨酸标签（Histidinetag）”，它具有蛋白质纯化和检测作用。通过使用His标签，科研人员能够快速、有效地获得高纯度的目标蛋白质，并在各种实验中对其进行详细分析。广泛应用于基础研究、结构生物学、功能研究以及生物技术和医药开发等领域。接下来，上海通蔚详细给大家介绍一下His标签。相关阅读：什么是HIS试剂盒？一文了解其用途研究

  His标签的基本原理和功能

  His标签的组成

  His标签是由6个组氨酸残基首尾相连组成的短肽序列，通常连接在蛋白质的N端或C端，用于重组蛋白的分离和纯化。由于His标签分子量小，它对重组蛋白的结构及生物活性通常没有显著影响。His标签能够与镍离子（Ni²⁺）或钴离子（Co²⁺）结合，通过金属亲和层析进行纯化。His标签的存在也允许通过抗His标签抗体进行特异性识别，从而用于定性和定量检测His融合蛋白的表达、细胞内定位等。

  His标签的基本原理

  His标签蛋白纯化通常采用固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化的方法。这种方法利用了His标签与金属离子的特殊相互作用，实现了对目标蛋白的分离和纯化。

  原理概述：His标签是由多个组氨酸残基组成的短肽，具有与镍（Ni²⁺）、钴（Co²⁺）等金属离子结合的能力。在IMAC层析柱中，这些金属离子通过螯合配体固定在介质上，形成了亲和层析填料。

  吸附和洗脱：带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时能够选择性结合在介质上，而其他杂质蛋白则不能或仅能微弱结合。通过调节洗脱缓冲液中的咪唑浓度，可以竞争性地洗脱目标蛋白，从而实现分离和纯化。

  选择的金属离子：在His标签蛋白纯化中，常用的金属离子包括Ni²⁺、Co²⁺和Cu²⁺。其中，Ni²⁺是最常用的金属离子，通常选择Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。

  His标签的主要功能

  蛋白质的亲和纯化

  在大肠杆菌等原核系统中表达的多组氨酸标签（His标签）重组蛋白通常通过固定化金属离子亲和层析（IMAC）进行纯化。在此过程中，载体材料（通常是珠状琼脂糖或磁性颗粒）衍生化为具有适当配体（如腈三乙酸（NTA）或亚氨基二乙酸（IDA））的形式。

  这些配体将固定所需的二价金属离子（如镍、铜、钴和/或锌），而这些金属离子又负责与目标生物分子和蛋白质混合物结合和分离。在选择配体时，需要考虑要纯化的蛋白质性质以及使用的金属离子。以下是对金属离子的选择的更详细描述：

  镍（Ni²⁺）：是最常用的金属离子之一，对His标记蛋白具有较高的亲和力和选择性。然而，它可能会与含有组氨酸簇的内源性蛋白质非特异性结合。

  钴（Co²⁺）：与组氨酸标签具有更特异的结合，因此在追求纯度的情况下是首选的二价阳离子。

  铜（Cu²⁺）：与His标签的结合力更强，但其特异性较低。因此，在不要求高纯度的情况下才使用铜IMAC。

  对于每种金属离子，都需要权衡其亲和性和特异性，并根据实验的特定需求做出选择。这样的纯化方法在生物制药和生物化学研究中得到了广泛应用，以提取具有特定标签的蛋白质，并保持其活性和结构完整性。

  蛋白质检测

  除了纯化多组氨酸标记的重组蛋白外，His标签还具有多种其他应用：

  ELISA或WesternBlot检测：

  您可以利用镍螯合辣根过氧化物酶来促进基于HRP的His标记蛋白检测，而无需使用抗体。或者，您也可以使用对带有组氨酸标签的蛋白质具有高灵敏度和特异性的抗6xHis抗体。

  蛋白质相互作用分析：

  镍琼脂糖树脂可用于纯化、鉴定和测量His标记蛋白的相互作用物，从而帮助研究蛋白质间的相互作用。

  微孔板涂层：

  镍或铜涂层微孔板可将粗或半纯化样品中的融合蛋白包被于各种板和报告基因检测中，用于高通量的蛋白质检测和筛选。

  凝胶染色：

  有几种免疫分析方法利用多组氨酸标签，通过抗多组氨酸标签抗体或SDS-PAGE检测目标蛋白，用于蛋白质的定性和定量分析。

  荧光标记：

  荧光六组氨酸标签的开发使研究人员能够更好地研究蛋白质的迁移和运输，提供了一种可视化的方式来追踪蛋白质在细胞中的动态过程。

  HIS标签优势

  His标签正逐渐成为分离纯化蛋白质及其他生物工程产物最有效的技术之一，His标签单克隆抗体可用于鉴定His标签蛋白的表达情况（如目标蛋白的相对表达量、分子量）、在细胞内的位置等特性。

  His标签是蛋白纯化的首选，其优点有：

  （1）N端His标签与细菌的转录翻译机制相兼容，有利于蛋白的表达；

  （2）采用IMAC（固定化金属离子亲和层析技术）纯化His标签融合蛋白更为方便；

  （3）His标签对目的蛋白本身的特性几乎不影响，不会改变目的蛋白本身的溶解性和生物学功能；

  （4）His标签很小，一般不影响蛋白的功能，且融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；

  （5）His标签的免疫原性较低，纯化的蛋白可直接注射入动物体内进行免疫和抗体制备；

  （6）与其他亲和标签构建成双亲和标签，可适用于多种表达体系，纯化条件温和；His标签融合蛋白应用范围广泛，可在非离子表面活性剂中纯化，也可在变性条件下纯化，前者通常用于纯化疏水性较强的目的蛋白，而后者通常用于纯化包涵体蛋白。

  His标签通常存在以下问题：

  (1)由于宿主蛋白的非特异性结合导致靶标纯度低

  （2）样品或缓冲液成分干扰蛋白质结合

  （3）由于缓冲液成分不兼容，纯化后蛋白质发生沉淀

  （4）哺乳动物细胞培养基干扰蛋白质结合或导致Ni2+泄漏

  （5）目标蛋白所需的pH值导致其从Ni-NTA琼脂糖中洗脱

  （6）由于标签-配体亲和力和特异性较低，在蛋白质分析中的适用性有限

  为了避免或解决这些问题，需要仔细规划流程并优化His标签纯化方案。最终，His标签可能仍无法达到令人满意的结果，或者可能根本不适合某种类型的蛋白质。在这种情况下，应考虑使用不同的亲和标签。

  通过上文介绍，相信你对His标签更了解，详情的了解His标签有助于后续实验纯化蛋白和检测蛋白。纯化蛋白和检测蛋白在生物学研究和医学应用中都具有重要的作用，它们为我们深入了解生物学过程、疾病发生机制以及药物研发提供了重要的实验手段和技术支持。