冷冻细胞：3个基本注意事项

  了解如何冷冻细胞是从事生物医学研究人员必不可少的知识。研究人员通常会冷冻原代细胞和细胞系，以便灵活安排实验时间并保持细胞质量。冷冻细胞库可确保检测结果的可重复性，并在细胞培养物受到污染或丢失时提供备用细胞来源。

  冷冻细胞是一个较为复杂过程，由于水是活细胞中最重要的成分，当水结冰时，细胞代谢就会停止。经过适当的解冻程序后，细胞会恢复正常的生物活动。

  冷冻保存细胞有许多优点，但由于细胞暴露在冷冻保护剂中并且冷冻所需的低温下，该过程可能会给细胞带来压力。上海通蔚为大家介绍大多数细胞冷冻方案。

  选择正确的冷冻介质

  选择正确的冷冻培养基取决于细胞系和应用，并且需要进行优化以确保解冻后最高的活力。

  对于大多数应用，应该考虑使用生长培养基血清或市售的冷冻培养基，例如二甲基亚砜（DMSO）。在开始细胞冷冻方案之前，请确保您已经准备好适合悬浮细胞的温度和体积的冷冻培养基。

  在进入冷冻程序之前，请记住在与细胞混合后多次上下吹打培养基以确保单细胞悬浮。此外，最好不要将悬浮液倒入低温小瓶中，因为这将大大增加污染风险。

  低温瓶和标签

  用于冷冻细胞的任何小瓶都应适合低温应用。这些小瓶应由聚丙烯制成，可承受低至-196°C的温度。使用聚酯低温小瓶和可耐受超低温的粘合剂为您的小瓶贴上标签。在粘贴到小瓶之前，请在标签上打印所有重要信息，例如日期、细胞类型、识别号和浓度。

  细胞冷冻率和长期储存

  将细胞分装到贴有适当标签的低温小瓶中后，即可开始冷冻程序。与解冻细胞不同，冷冻过程是一个缓慢、可控的过程。让冷冻保护剂有时间从细胞中去除水分至关重要，这可以降低因冰晶形成而造成损害的风险。

  当细胞被快速冷冻时，水和离子往往会留在细胞中。这最大限度地减少了溶质浓度效应和脱水。然而，细胞内的冰形成会通过撕裂和刺穿细胞膜造成严重损害。相反，如果细胞缓慢冷冻，细胞外的水会在细胞内冰形成之前结冰。这允许水通过渗透逸出，但会增加细胞内溶质的浓度，而这可能是有毒的。

  实际上，非常快和非常慢的冷冻速度都会导致过量冰形成或溶质毒性增加。DMSO等冷冻保护剂可促进脱水、减少冰结晶并降低溶质效应。对于大多数细胞来说，最佳冷冻速度是每分钟1°C。正如您在图表中看到的，在这个温度范围内，细胞内冰形成的负面影响与溶质浓度的增加达到平衡。

  这将使细胞活力达到最大。

  冷冻细胞通常是一个两步过程，其中细胞以缓慢、可控的速率冷却至-80°C，然后在-135°C或更低的温度下长期储存。

  步骤1：以控制的速率将细胞冷冻至-80°C

  如前所述，必须使用控速冷冻机或控速容器将细胞以每分钟约-1°C的速率冷却至-80°C。

  将冻存瓶放入容器后，可将其放入-80°C冰箱中过夜。12小时后，冻存瓶即可转移至液氮冰箱中进行长期保存。

  值得注意的是，应避免将细胞在-80°C冰箱中储存超过两周。在此温度下储存时间过长会导致细胞死亡和样品活力降低。

  步骤2：在液氮中长期储存

  液氮储存方法有两种基本类型。一种是将小瓶直接浸入液体中。另一种是将小瓶置于液体上方的气相中。

  气相系统在容器内形成垂直温度梯度。在底部，液氮将保持约-196°C的温度。

  气相温度在到达容器顶部时会升高。应使用足够的液氮，以确保罐顶部最热部分的温度始终低于-135°C。

  我们建议将小瓶储存在气相中，而不是液相中。代谢活动在-135°C时停止，而液相的额外低温并没有带来真正的好处。

  事实上，将小瓶浸入液相中存在部分液氮可能渗透并损坏小瓶的风险。

  对于从事免疫学、毒理学和其他科学领域的研究人员和实验室工作人员来说，学习如何冷冻细胞并使其在解冻后保持最大活力是一项重要技能。

  总而言之，制定细胞冷冻方案时主要考虑三个因素：冷冻介质的类型和浓度、低温小瓶的类型、最佳冷冻速度和长期储存温度。

  最好使用含有冷冻保护剂（如DMSO）的冷冻介质来冷冻健康且可存活的细胞。

  冷冻培养基细胞浓度取决于细胞和应用，因此需要进行优化以实现长期储存。

  低温瓶应带有外螺纹，额定温度为-196°C。

  冷冻细胞时，确保控制冷却速度为-1°C/min，直至达到-80°C，然后转移到液氮罐的气相中进行长期储存。