科研人员在做ELISA实验时需要注意哪些问题？

  酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种用于检测和定量分析抗原和抗体的实验室技术。ELISA与其它免疫检测技术相比，操作还是较为简单。虽说操作简单，但是实验中经常会遇到一些问题，今天通蔚为大家整理这些常见的问题。

  1.标准曲线不佳

  2.无信号

  3.变异系数高

  4.背景高

  做ELISA实验需要注意哪些问题？

  标准曲线不佳

  在ELISA实验中，标准曲线至关重要，通过标准曲线可以确定样品中目标分子浓度。在每次进行ELISA实验时候，可以使用和准备质量控制（QC）样品。在较为理想的情况下，QC样品涵盖了低、中、高浓度，覆盖标准曲线的整个范。可以将它们分别放在ELISA板左侧和右侧（第1列和第12列）。这些QC样品的浓度应与标准曲线上的浓度不同，模拟已知浓度的实际样品以进行准确性验证。

  在理想的情况下，将QC样品基质与您的真实样品（例如血清或血浆）相匹配。建议提前准备一批QC样品并将其储存在-80°C下，就像您的常规样品一样。这样，您就可以监控一段时间内或不同生产批次的检测性能，前提是您的分析物在您的存储条件下保持稳定。 在QC样品用完之前准备好新的批次，并同时运行新旧两批QC样品进行比对，这对于确保实验结果的一致性和可靠性至关重要！

  标准曲线常见问题

  标准曲线的常见问题可能包括不同浓度下的光密度(OD)值不一致，导致曲线拟合度较差且R²值较低（理想情况下，R 2应>0.99）。常见问题如下：

  问题1标准溶液不正确

  使用错误浓度的标准起始溶液可能会导致标准稀释不足或过度稀释，从而导致OD偏差并使标准曲线超出范围。

  解决办法：仔细检查标准储备液浓度、稀释计算和稀释度。如果您要从冻干小瓶中重构标准品，请确保遵循厂家的说明。建议涡旋小瓶以确保完全重构。

  问题2降解标准

  过有效期或储存不当的标准品可能已经降解，导致OD值低于未降解的标准。

  解决办法：验证标准品是否正确重构或适当存储

  问题3曲线不符合比例

  即使你认为曲线没问题，也可能观察到比平时更高或更低的OD值。这可能是由于检测试剂批次不同等因素导致吸光度变化。

  解决办法：首次使用ELISA试剂盒时，请确保使用推荐的曲线拟合模型，通常是4或5参数逻辑曲线拟合模型(4-PL或5-PL)。如有必要，请尝试其他曲线拟合模型，如对数-对数。一致性是关键，因此更改曲线拟合模型可能会导致您的结果在检测之间无法比较，尤其是在需要绝对值的情况下。

  问题4移液误差

  向板中添加样品时可能会发生移液误差，例如样品量不正确或变异系数(CV)过高。

  解决办法：为了最大限度地减少移液错误，请确保移液器吸头牢固连接，在试剂和样品之间更换吸头，消除孔或移液器吸头中的气泡，将试剂/样品分配到孔的侧面，并通过连续的抽吸/分配循环冲洗吸头。

  注意事项：可以先暂时保留您实验试管，一直到分析结果完成。保留用于制备标准品、QC样品和样品的试管，可以让您在稍后发现错误时仔细检查稀释错误或试管混淆。

  无信号

  由于ELISA中的每个步骤都至关重要，信号缺失的潜在原因有很多，因此故障排除是一个综合过程。常见问题如下：

  问题1无样品信号，但标准品或QC样品良好

  如果您的标准/校准曲线和/或QC样品显示信号，但您的样品没有（如预期），则您的样品可能有问题。可能出现以下几种问题：

  1.使用新的样本基质：ELISA实验的成功与否很大程度上取决于样本基质和所选用的ELISA试剂盒的兼容性。不同的样本类型（例如血清、血浆、尿液、组织匀浆、细胞培养上清等）具有不同的成分和特性，这些差异可能会影响ELISA实验的结果。

  2.稀释度过高：样品过度稀释超过ELISA的灵敏度可能会导致信号丢失。

  3.降解样本

  完全无信号

  有多种原因可能导致零信号产生：

  1.孵育时间/温度：验证孵育时间和温度是否符合厂家要求，以避免影响检测动力学。

  2.捕获/检测抗体不足/不正确：仔细检查抗体稀释度，特别是内部制备的试剂，并确保正确订购厂家提供的即用型试剂。

  3.添加的捕获/检测试剂不足：确保向板中添加了正确量的试剂。

  4.读取器波长：确认您的平板读取器上的波长设置正确，特别是在使用需要视觉停止的底物时。

  5.底物溶液：使用正确的底物并检查储备溶液的有效期。

  6.洗板：避免过度剧烈或长时间洗板，因为这可能会洗掉分析物或试剂。

  7.干燥孔：防止孔变干，以避免出现不可预测的ELISA问题。

  高CV

  高CV可能表现为重复孔之间的光密度读数存在显著差异，并且可能对板的某些部分产生不同的影响。解决问题取决于确定高CV的具体位置，因为它会影响曲线拟合和结果可靠性。

  以下是ELISA中CV值高的一些常见原因：

  1.移液误差：虽然通常归因于移液误差，但高CV也可能由样品制备、试剂处理和清洗步骤中的错误造成。确保稀释样品混合正确，以避免重复样品之间存在差异。

  2.样品准备：将稀释样品加入板中之前，大力混合或用移液器吸出稀释样品，以避免分析物分布不一致。

  3.试剂准备：试剂（如捕获抗体或检测抗体）混合不当可能会导致不同孔中的试剂水平不同，从而增加CV。

  4.洗板：确保彻底、一致地洗板，以防止板上残留基质成分，导致背景信号增加。

  5.孔内气泡：移液时尽量减少气泡，因为气泡会干扰分析物或试剂。读取板前应消除所有可见气泡。

  6.边缘效应：注意边缘效应，这可能是由于板上的温度差异造成的。控制温度并确保适当的试剂混合可以缓解此问题。

  高背景

  ELISA中的高背景表现为整个板的颜色显色或光密度读数过高。高背景会增加信噪比，降低检测灵敏度并可能导致结果不可用。高背景通常有两个主要原因：板清洗和板阻塞。

  如果您在一段时间内做大量相同的ELISA，请将空白（阴性对照）、标准和任何QC样品孔的光密度制成表格。这可以让您了解检测或试剂是否随时间而变化，从而导致检测动力学逐渐发生变化。

  1.基于抗体问题

  包被/检测抗体浓度：在ELISA实验中，包被抗体（也称为捕获抗体）的浓度非常关键，需要仔细选择和优化，特别是当你不是使用现成的试剂盒，而是从头开始开发ELISA方法时。

  非特异性结合：检查抗体的配方，确保所用的稀释剂合适，因为不兼容的稀释剂会导致非特异性结合。充分的板封闭对于减少非特异性结合至关重要。

  交叉反应性：当转换新批次、新供应商或新类型的抗体时，请使用阴性对照检查是否与样品类型中的其他分析物发生交叉反应。

  2.试剂（缓冲液或底物）问题

  污染：由于之前的背景较高而重复检测时，请始终使用新鲜试剂。受污染的缓冲液可能导致背景较高。

  3.板材阻挡：

  封闭缓冲液在检测中至关重要，因为它可以防止非特异性结合。为了降低高背景，可以考虑增加封闭溶液的浓度或添加少量非离子洗涤剂，例如Tween-20。延长封闭步骤的孵育时间和使用平板振荡器也有帮助。

  4.洗板：

  洗板不充分会导致基质成分残留在板上，从而导致背景信号增加。清洗步骤或在清洗步骤之间短暂孵育可有效降低背景。确保自动洗板机正常运行，并且在更换清洗缓冲液之间管路清洁且冲洗干净。

  5.基底问题：

  如果反应未在规定时间内停止，某些底物（如TMB）可能会沉淀。请遵循制厂家的建议，并在添加终止液后立即读取板。确保检测板底部清洁，以防止干扰板读取器。