当您进行组织样本的ELISA实验时，蛋白浓度的均一性是非常关键的，因为蛋白浓度的差异可能导致结果的不一致性。因此，确实需要对每个样品进行蛋白定量以确保各样品有相同或已知的蛋白浓度。今天，通蔚给大家介绍一下elisa如何定量蛋白浓度，在开始之前，我们先知道elisa测定生物样品中目标蛋白的浓度的三种类型：
定量：可以通过系列稀释的标准蛋白的OD值和相应的已知浓度来生成标准曲线。样品的 ELISA 数据可以从标准曲线插值来计算样品中目标蛋白的浓度。
定性：我们简单地从检测中得到阴性或阳性结果，通过与阴性对照比较来确定某个样品中是否存在任何目标蛋白。
半定量：使用这种类型的ELISA 试剂盒，我们可以获得阴性或阳性结果，并比较检测样品中的目标蛋白水平，因为样品的吸光度水平将直接对应于目标蛋白的水平专注。然而，由于试剂盒中没有任何标准蛋白，我们无法计算出准确的浓度。
一般来说，使用定量ELISA试剂盒，您可以对样品中的目标蛋白进行定量，因为您测试了一系列已知浓度的标准蛋白。当您使用定量 ELISA 试剂盒分析 ELISA 数据时，您必须绘制平均吸光度与蛋白质浓度的关系，并绘制最适合您的标准结果的曲线，然后将样品的吸光度插入曲线以计算浓度。该 ELISA 标准曲线实验方案将为您提供有关如何使用定量 ELISA 试剂盒逐步计算 ELISA 结果的全面说明。
关于样品中目标蛋白的浓度，向您推荐一款使用简单的ELISA数据分析软件Curve Expert 1.4。市场上还有许多其他曲线拟合软件可以进行 ELISA 计算，例如GraphPad Prism，或者您也可以使用普通的 MS Excel 进行分析。
一、如何使用Curve Expert绘制标准曲线并计算目标蛋白浓度？
处理 ELISA 数据分析分为三个步骤：
1、将标准品的ELISA数据输入软件
2、选择最佳拟合曲线
3、通过插值计算目标蛋白的浓度
现在我将一步步向您展示如何制作ELISA标准曲线。
1. 将标准品的ELISA数据输入软件
进行 ELISA 测定后，您可以将原始数据分为三个部分。建议运行一式两份或一式三份的标准品和样品。作为zui佳实践，您最好将重复的 CV 控制在 8% 以下。
第1部分：已知浓度标准品的吸光度
第 2 部分：空白孔/背景的吸光度
第3部分：未知浓度样品的吸光度
标准品用样品稀释剂连续稀释。样品可能还需要稀释。由于即使在检测波长处不存在蛋白质，样品稀释剂也具有吸光度，因此我们在测定中使用样品稀释剂进行空白实验以获得背景 OD。通常的做法是从标准品和所有样品的吸光度中减去空白孔的吸光度。
这里我们以“Curve Expert 1.4”为例，向您展示如何操作该软件并进行数据分析。
1.1启动“Curve Expert 1.4”。您可以看到下面的界面。
1.2输入标准品的OD值（X轴）和相应的浓度（Y轴）。您可以将 Excel 工作表中的数据直接复制到软件中的工作表中。数据图出现在右下角。
2.选择最佳拟合曲线
2.1 单击[运行]按钮，让软件检查您的数据以选择最佳的曲线拟合。选择要包含在计算中的模型系列。通常，我们点击 [ All On ] 来包含所有型号系列。如果考虑多项式族，则必须在“多项式约束”区域中指定软件将考虑的多项式的最大次数。我们建议将多项式的最大次数设置为“4”。当然，如果不包括多项式族，则多项式约束将被忽略。然后按[确定]。
2.2 然后进行计算，每条曲线拟合根据其标准误差和相关系数进行排序，然后将最佳拟合显示在图形窗口中。
虽然软件会推荐最佳拟合曲线，但您仍然可以通过双击不同的回归来手动选择曲线。选择“r”值最接近“1”的曲线。
选择适当的曲线拟合回归很重要，因为样品浓度将根据标准曲线计算。下图说明了不同的 ELISA 标准曲线如何影响浓度计算的准确性。 “r”值越接近“1”，OD 和浓度之间的相关性越强。
在本例中，我们最终选择“有理函数”，因为与其他标准曲线相比，其“r”值最接近“1”。通过在任何绘图窗口中按鼠标右键或按 Ctrl-M，您可以从绘图菜单中进行选择。通过点击[复制]按钮，您可以将标准图形粘贴到Excel表格或Word文档中。
二、通过插值计算目标蛋白浓度
如何计算浓度？有两种方法可以计算目标蛋白的浓度。
该软件可以轻松定位 x/y 点、微分以及通过从绘图菜单中选择“分析”或按 Ctrl-L 执行的曲线拟合积分。在此示例中，我们希望通过评估给定 OD（X 值）下的曲线拟合来找到目标蛋白的浓度（Y 值）。只需在“At X=”字段中输入要评估曲线拟合的点（x 值），然后按键盘上的[ Calculate ] 或 [ Enter ]。然后计算器将显示相应的 y 值。
按 [ Info ] 按钮打开模型信息对话框，其中提供应用曲线拟合所需的所有信息以及有关给定模型性能的一些补充信息。该面板中包含的最重要的信息是模型参数的值。
模型
模型部分给出了数据建模方程，以便系数的解释清晰。系数部分中的系数 a、b、c 等与模型中显示的相应参数相匹配。
系数
系数部分给出当前模型的相关参数值——这些系数始终表示为 a、b、c、d 等。这些系数与模型部分中显示的模型相匹配。如果系数列表超出了它们显示的窗口范围，则会出现一个滚动条，允许您滚动浏览参数。
如果我们单击[复制]，系数列表将被复制到剪贴板。然后将它们粘贴到任何 Excel 工作表中
将X(OD)、a、b、c、d值分别带入公式中，然后按键盘上的[ Enter ]键即可计算出浓度。为了得到最准确的结果，建议预先确定合适的稀释倍数，确保稀释后样品中目标蛋白的浓度落在标准曲线范围内。如果样品已被稀释，则计算时应考虑稀释因子。
标准曲线对于准确分析 ELISA 结果非常重要。因此，您应该在每次测定中运行标准品，以避免由于每次测定的操作员、移液、孵育和温度的差异而导致系统偏差。
上述是以人TNF-α ELISA试剂盒为例通过Curve Expert绘制标准曲线并计算目标蛋白浓度，大家可以参考。Curve Expert软件可能是一个收费的软件，您可以通过Excel或其他软件制作标准曲线，或者您可以将您的数据发送给我们，我们将为您处理数据。如果还有不明白的可以咨询我们专业的elisa试剂盒顾问寻求免费解答！在这里通蔚祝您实验顺利！
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