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品质保证 · 通蔚试剂
021-54845833/15800441009品质保证 · 通蔚试剂
发布时间：2024-05-21 发布作者：上海通蔚生物
准确的蛋白质定量是大多数蛋白质研究中的关键步骤。研究生物分子之间的相互作用对于理解它们的功能非常重要。研究蛋白质与其他分子间的相互作用是理解其功能的关键，并且在许多其他领域具有应用，包括在药物发现、开发等领域有着广泛应用。
本文的目的主要是介绍如何正确测定蛋白质浓度的关键方法和注意事项。蛋白质浓度测定是蛋白质研究的基础，对其准确性要求很高，并详细介绍了不同测定方法的优缺点和注意事项。本文将重点介绍不同测定方法的优缺点，帮助您选择最适合其研究的方案。
6.蛋白质定量的应用
蛋白质浓度定义为样品中特定蛋白质或一系列不同蛋白质的总量或含量。
蛋白质浓度测定在蛋白质生物学和分子生物学中是必要且广泛应用的。蛋白质定量分析涉及生产和科研的多个领域和行业，是生物学、食品检验掺假、临床检验、疾病诊断、质量检验等领域最常用的方法。在分离、纯化和分析之前必须计算蛋白质样品的浓度。
蛋白质定量对于更好地了解样品或配方产品中的总蛋白质含量是必不可少的。这是涉及蛋白质提取或分析的任何实验工作流程中的重要程序。精确的蛋白质浓度是为后续实验生成可靠数据的关键。
蛋白质的定量方法有很多种，其中常见的有凯氏法、双缩脲法、Lowry法、BCA法、Bradford法、紫外光吸收法(280nm)等六种。
蛋白质浓度的测量主要基于两个原则：一是利用蛋白质的共同特征，如氮、肽键、折射率等，二是利用特定的氨基酸残基，碱性或酸性蛋白质中的基团和芳香族基团可测定蛋白质含量。
凯氏定氮法由JohannKjeldahl于1883年发明。它包括消化、蒸馏和滴定三个步骤。在该方法中，用浓酸和催化剂消化蛋白质后，总有机氮转化为硫酸铵。添加NaOH来中和沼渣并将铵转化为氨。蒸馏出氨并收集在过量硼酸的接收瓶中以形成硼酸铵。通过使用合适的滴定技术滴定残留的硼酸来测量样品的总氮含量。需要使用转换因子(F)将测得的氮浓度转换为蛋白质含量。
比色测定方法基于响应蛋白质而在可见光谱中产生有色溶液。颜色变化与蛋白质浓度成正比，并通过特定波长下的吸光度测定来测量。通常，使用牛血清白蛋白（BSA）标准溶液绘制的标准曲线来测定蛋白质含量。比色测定包括缩二脲试验、Lowry测定、二辛可宁酸(BCA)测定和考马斯蓝G-250染料结合(Bradford)测定。
双缩脲试验，也称为Piotrowski试验，是一种测定样品中总蛋白质的化学方法。由于蛋白质分子中肽键（-CONH-）的结构与缩二脲相似，因此蛋白质在碱性溶液中也能与铜离子（Cu2+）反应生成紫红色化合物。
在缩二脲法中，Cu2+被蛋白质内的两个肽键还原，然后螯合成紫色络合物。产品的颜色强度与蛋白质浓度成正比，并通过540nm处的吸收光谱进行测量。
后来，缩二脲试验经过改进，进而发展为肽的两种比色分析：Lowry测定法和BCA测定法。
Lowry测定法由OliverLowry于1951年首次提出[1]。在Lowry法中，肽键首先在碱性条件下将铜离子还原成亚铜离子。Folin-Ciocalteu试剂随后与亚铜离子以及酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的侧链反应，产生一种深蓝色复合物，称为杂多钼蓝。杂多钼蓝的颜色强度与样品中的蛋白质含量呈正相关，通过660nm处的吸光度进行测量。
BCA测定是在Lowry测定的基础上改进的。在BCA测定中，蛋白质肽键螯合Cu2+离子，并在碱性条件下将其还原为亚铜离子(Cu+)[2]。Cu+离子与BCA反应形成紫色络合物，其颜色强度通过562nm处的吸光度测定来测量[2][3]。吸光度与蛋白质浓度在很宽的范围内具有良好的线性关系。
Bradford测定法最初由MarionM.Bradford于1976年开发[4]，是一种染料结合方法，基于考马斯亮蓝G-250染料-蛋白质相互作用引起的颜色变化。考马斯G-250染料与蛋白质上的可电离基团发生反应，导致蛋白质构象发生变化并随后暴露疏水袋[4][5]。该染料与疏水性氨基酸结合，形成稳定的蓝色复合物。蓝色复合物的颜色强度可以通过595nm处的吸光光度测定法进行测量。吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。
这是一种通过测量样品在280nm处的紫外吸光度（A280）来直接测定蛋白质浓度的方法。蛋白质中的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸能吸收紫外光[6]，这些芳香族氨基酸的吸收峰在280nm波长处，且吸收峰的光密度与它们的浓度成正比，因此可以作为蛋白质定量测定的依据。由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，需要知道它们的消光系数（ε），作为准确定量的参考。ε系数可以通过实验测定，也可以根据氨基酸序列计算得出。
在ELISA中，目标蛋白被酶标记的特异性抗体捕获，然后通过与其底物的酶反应进行定量。通过酶标仪在特定波长下测量所产生的复合物的光吸收。酶-底物反应产生的颜色强度与样品中的蛋白质浓度成正比。参照标准曲线计算蛋白质浓度。现在市场上有各种优质的定量ELISA试剂盒，为特定蛋白的定量提供了更多的便利。
基于上述蛋白定量原理，各种蛋白检测试剂盒也逐渐面世，主要包括BCA蛋白检测试剂盒和Lowry蛋白检测试剂盒，实现了蛋白浓度测定的简单、高稳定性、高灵敏度和高兼容性。
当测定样品中的蛋白质含量时，首先要考虑的是选择合适的测量方法。由于可用的蛋白质检测方法多种多样，因此我们需要考虑许多因素，以确保所使用的检测方法最适合应用。每种测定都有其自身的优点和局限性。由于没有一种试剂可以被认为是理想或最佳的蛋白质测定方法，因此还可能需要获得一种以上类型的蛋白质测定用于研究应用。
没有单一的测定可以用来量化所有蛋白质类型。因为在选择与样品最相容的适当方法之前，需要考虑某些方法的具体限制。为了确保测量数据准确，必须考虑几个因素。
选择合适的方法取决于样品中蛋白质的特性以及分析方法的特征。一般来说，选择蛋白质浓度测定方法需要考虑许多因素，包括样品或裂解缓冲液中的干扰剂、测定灵敏度和样品体积、样品制备、分析速度、便利性和试剂的可用性、测定时间、蛋白质标准、蛋白质样品的稀释度、蛋白质之间的变化、设备要求以及与待分析样品的缓冲液成分的兼容性。
蛋白质浓度的测量对于蛋白质纯化、电泳、细胞生物学、分子生物学和其他研究应用是必要的。
紫外吸收法在蛋白质、酶的生化制备中应用十分广泛，此方法适合配合色谱柱实时监测蛋白质的吸附或洗脱情况，但结果不太准确。
Bradford方法适用于大规模样品分析，但样品中不应含有高浓度的去污剂，这需要更严格的样品标准。建议一般使用，特别是用于评估细胞组分的蛋白质含量和估计凝胶电泳的蛋白质浓度。
Lowry方法用于测量酶分级过程中的蛋白质、混合组织蛋白质、测量极少量的蛋白质或高度稀释的蛋白质以及分析大量相似的蛋白质样品。
标准BCA测定可用于确定每个均质样品的蛋白质浓度。
不同的蛋白质定量方法各有优缺点，没有一种方法能够完美适用于所有实验。选择合适的测定方法需要根据实验需求，权衡测定时间、灵敏度、准确度等因素。希望这篇文章能帮助读者更好地了解各种蛋白质定量方法，并选择最适合其研究需求的方法。
引用参考：
[1] Lowry OH, Rose Brough NJ, et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov;193(1):265-75.
[2] Gornall AG, Bardawill CJ, David MM. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J Biol Chem. 1949;177:751–766.
[3] Smith PK, Krohn RI, et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985;150:76-85.
[4] M M Bradford. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem. 1976 May 7; 72:248-54.
[5] Sedmak JJ, Grossberg SE. A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using Coomassie brilliant blue G250. Anal Biochem. 1977;79:544–552.
[6] Simonian M. H. Spectrophotometric determination of protein concentration. In: Wrolstad R. E., editor. Handbook of Food Analytical Chemistry. New Jersey, NJ, USA: John Wiley & Sons; 2000. pp. 115 -121.