二辛可宁酸 (BCA) 蛋白质检测：材料、步骤及关键技巧

  蛋白质定量是许多生物研究和工业过程中的关键步骤。准确测量蛋白质浓度对于各种应用至关重要，例如研究蛋白质-蛋白质相互作用、评估酶活性以及确定下游分析的蛋白质浓度。二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定因其高灵敏度、重现性以及与各种样品类型的兼容性而成为广泛使用的蛋白质定量方法。

  二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定原理

  二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定法是一种广泛使用的定量测定样品中总蛋白质的方法。BCA测定依赖于在碱性条件下，蛋白质将Cu²⁺离子还原为Cu⁺离子。随后，生成的Cu⁺离子与BCA试剂反应，形成一种吸收562nm波长光的紫色络合物。使用分光光度计测量该络合物的吸光度。生成的络合物的量与样品中蛋白质的含量成正比，因此通过测量吸光度可以间接确定样品中的蛋白质浓度。

  为什么要进行二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定？

  二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定是一种可靠且灵敏的定量测定样品中总蛋白质的方法。它比Bradford测定更灵敏，能够检测低至0.5μg/mL的蛋白质浓度。BCA测定对非蛋白质来源的干扰具有更高的耐受性，例如去污剂、还原剂和脂质，这些物质可能会干扰其他蛋白质测定方法。由于其高灵敏度和对干扰物质的耐受性，BCA测定广泛应用于生化研究、生物技术和临床诊断中，用于定量各种样品类型（例如血清、血浆和细胞裂解物）中的总蛋白质。相关阅读：8种蛋白质浓度检测方法详解

  二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定方案

  材料：

  BCA工作试剂（见下方配方）

  BSA标准品（见下方配方）

  蛋白质样品

  96孔微孔板

  酶标仪

  BCA工作试剂配方：

  BCA试剂A：含有50mg/mL二辛可宁酸的2%碳酸钠溶液

  BCA试剂B：含有4%硫酸铜的0.4N氢氧化钠溶液

  将50份BCA试剂A与1份BCA试剂B混合，混匀后在室温下孵育30分钟备用。

  BSA标准品配方：

  将10mgBSA溶解在10mL蒸馏水中，制成1mg/mL储备液。制备一系列已知浓度范围为0至2mg/mL的BSA标准溶液，使用蒸馏水进行稀释。

  程序：

  1、将50份BCA试剂A和1份BCA试剂B混合，制备BCA工作试剂。混匀后在室温下孵育30分钟备用。

  2、制备一系列已知浓度范围为0至2mg/mL的BSA标准溶液，使用蒸馏水进行稀释。

  3、将10μL每种BSA标准溶液和蛋白质样品分别移入96孔微孔板的单独孔中。

  4、向每个孔中添加200μLBCA工作试剂。

  5、通过轻轻移液或摇动板子充分混合。

  6、在37°C下孵育板子30分钟。

  7、孵育后，将板子冷却至室温。

  8、使用酶标仪在562nm处测量吸光度。最好在反应停止后30分钟内读取吸光度。

  9、使用BSA标准品的吸光度值绘制标准曲线。

  10、使用标准曲线计算样品中的蛋白质浓度。

  成功进行二辛可宁酸(BCA)蛋白质检测的技巧：

  1、确保BCA工作试剂在使用前充分混合。

  2、使用不含蛋白质的样品作为空白对照来校准微孔板读数仪。

  3、使用BSA作为标准蛋白质，因为它具有明确的结构并且在溶液中稳定。

  4、使用蒸馏水制备所有溶液并稀释蛋白质样品。

  5、避免蛋白质样品中含有高浓度的去垢剂或还原剂，因为它们会干扰测定。

  二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定法是一种可靠且灵敏的定量方法，适用于各种科研领域中的蛋白质检测。本方案详细介绍了BCA试剂的配方、标准品的制备以及具体的操作步骤，并提供了一些成功进行检测的技巧。这些指导不仅能帮助科研人员在实验中获得准确和一致的结果，还能减少由于干扰物质引起的测定误差。通过遵循上述方案，科研人员能够高效地进行蛋白质定量，从而支持进一步的生化研究和应用。希望本指南能为您的科研工作提供实质性的帮助。