二抗选择：提高实验结果准确性的关键

  在免疫学实验中，通常会用到二抗，二抗通过与一抗结合，进而与靶抗原结合，促进靶分子的间接检测。二抗在免疫学实验中起着举足轻重的作用，二抗的选择也决定整个实验的成败。了解一抗和二抗可以参考这篇文章《一抗和二抗简介》

图 1.直接与间接免疫测定

  二抗间接检测优势

  提高灵敏度——多个二抗与单个一抗结合会导致信号放大。

  灵活性——通过与多个一抗配对，相同的二抗可以用于检测多个目标。

  用途更广泛——根据预期应用，相同的一抗可以与各种二抗配对（例如，用于蛋白质印迹的HRP结合物和用于IF/FC的荧光结合物）。

  容易获得——针对大多数物种的二抗可从多个商业供应商处以多种结合物选择广泛获得。

  选择二抗

  在应用中选择合适的二抗取决于多种因素（如下所述），以确保高度灵敏和准确地检测目标抗原。

  1.靶标特异性–二抗必须针对一抗的宿主物种产生。例如，如果一抗是在小鼠中产生的，则二抗必须是抗小鼠的，并且在小鼠以外的宿主物种中产生（例如，山羊抗小鼠二抗）。此外，二抗应该对一抗类或亚类具有特异性。由于大多数多克隆一抗是针对同种型IgG产生的，因此使用的二抗应该识别IgG重链和轻链（抗IgGH+L）。另一方面，单克隆一抗是针对特定IgG亚类产生的，因此需要亚类特异性二抗来检测它们。

  2.克隆性——传统上，抗体被分为多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆二抗是识别同一抗原上不同表位的异质抗体群，而单克隆二抗是识别抗原上相同表位的同质抗体群。在决定抗体克隆性时，选择取决于预期应用的更重要因素——特异性或灵敏度。虽然单克隆二抗比多克隆抗体具有更好的特异性，并且是需要高度特异性靶标检测的应用的首选（例如，用于检测特定的小鼠同种型），但多克隆二抗比单克隆二抗灵敏得多，因此用于需要高灵敏度的应用（例如，用于检测低丰度靶标）。

  3.宿主物种–宿主物种是指生产二抗的动物。确保二抗宿主与生产一抗的宿主动物不同非常重要。虽然大多数一抗是在兔子或老鼠体内生产的，但山羊是市售二抗最广泛使用的宿主动物。

  进行多重实验时，虽然建议所有一抗均来自同一宿主物种，但使用的二抗应在同一宿主物种中产生。这有助于防止二抗与非目标物种的一抗之间发生交叉反应。

  4.抗体形式——二抗有多种形式，包括完整抗体和抗体片段。二抗形式的选择取决于抗体的预期应用。例如，对于组织样本中的IHC和IF，包括F(ab')2和Fab'的抗体片段比完整抗体更受欢迎，因为它们的尺寸更小，可以更好地穿透组织。此外，由于片段二抗缺乏Fc区，它们有助于消除Fc区与某些细胞类型（B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞）上的Fc受体非特异性结合导致的高背景，从而使它们非常适合用于富含Fc受体的样本。然而，需要记住的一点是，片段抗体的灵敏度低于完整抗体，因为它们的尺寸较小，可以结合更少的染料或酶分子。

  5.结合物类型——二抗结合物的选择主要取决于两个因素：(i)二抗的应用，以及(ii)该应用中使用的检测方法。例如，在进行蛋白质印迹实验时，虽然HRP标记的二抗用于化学发光检测，但建议使用荧光染料标记的二抗进行荧光检测。下表根据预期应用和检测方法重点介绍了建议的二抗结合物。

应用	二抗偶联物
蛋白质印迹	酶标记二抗，例如用于化学发光检测的 HRP 和用于比色检测的 AP 荧光标记的二抗可用于荧光检测
免疫组织化学	用于显色 IHC 的酶标记二抗（例如 HRP 或 HRP 聚合物） 用于信号放大的生物素化二抗 用于荧光 IHC 的荧光标记二抗
免疫荧光	荧光标记的二抗 HRP 标记的二抗可用于基于 TSA 的检测
流式细胞	荧光标记的二抗 酶标记的二抗 生物素化的二抗可与荧光标记的链霉亲和素一起使用
酶联免疫吸附试验	生物素标记的二抗 酶标记的二抗

  6.交叉吸附抗体——交叉吸附二抗是传统的多克隆二抗，经过额外的纯化步骤以消除与非目标物种的非预期IgG的交叉反应。当二抗与样品中的内源性免疫球蛋白结合或在多路复用应用中与脱靶抗体结合时，交叉反应可能导致高背景或非特异性信号。交叉吸附通过将亲和纯化的多克隆二抗通过含有固定化抗体或其他物种血清蛋白的柱子来帮助提高抗体特异性。这有助于捕获柱中的非特异性抗体，同时允许在流过液中收集没有交叉反应的抗体。

  好了，上述为大家介绍了二抗的选择。如果你在免疫学实验中经常出现无法识别目标抗体、产生假阳性结果、降低实验灵敏度等因素，要留意欧联二抗是否选对。当然，你可以结合文章介绍对应判断，文章给大家一个参考。这里，通蔚也祝福您在免疫学实验中提高实验的成功率。