免疫印迹法的原理和步骤

  Westernblot，又称免疫印迹法，是由Towbin等人在1979年发展完善，并由W.NealBurnette于1981年命名的常用蛋白质分析方法。该技术可用于定性和半定量分析蛋白质。Westernblot主要包括三个步骤：按大小分离蛋白质（通常使用SDS-PAGE），将蛋白质转移到固体支持物（例如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上，以及使用抗体（通常是一抗和二抗）标记目标蛋白质以便进行可视化。需要注意的是，Westernblot的半定量分析需要谨慎操作并使用合适的内参对照。

  WesternBlot的原理

  Westernblot是一种利用抗体特异性检测蛋白质的技术。首先，蛋白质样品通过SDS-PAGE按分子量大小分离，然后通过电泳转移到固相支持物（例如NC膜或PVDF膜）上。膜通过疏水作用和静电作用吸附蛋白质。为了防止抗体非特异性结合，使用封闭液（例如蛋白质溶液、脱脂牛奶或BSA）封闭膜上未结合蛋白质的位点。接下来，将膜与针对目标蛋白质的一抗孵育，使一抗特异性结合到目标蛋白质上。洗涤去除未结合的一抗后，再用标记的二抗孵育。二抗与一抗结合，并通过其标记物（例如酶或荧光染料）放大信号，从而实现目标蛋白质的可视化和检测。通过比较条带的强度，可以对目标蛋白质进行半定量分析。

  WesternBlot步骤

  蛋白质印迹法涉及六个步骤，包括样品制备、凝胶电泳、蛋白质转移、阻断、抗体孵育以及蛋白质检测和可视化。

  1.样品制备

  蛋白质可以从不同的样品中提取，例如组织或细胞。由于组织样品的结构程度较高，因此首先通过机械装置（例如均质机或超声处理）分解组织。通常使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂来防止样品在低温下消化。蛋白质提取后，检测蛋白质的浓度很重要，这允许测定每个孔中装入的蛋白质的质量。分光光度计通常用于蛋白质浓缩。

  2.凝胶电泳

  最常用的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶(PAG)和装有十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液。Westernblot使用两种类型的琼脂糖凝胶：浓缩凝胶用于将所有蛋白质浓缩在一个带中，分离凝胶可根据蛋白质的分子量进行分离。在SDS-PAGE中，施加电压时，较小的蛋白质迁移得更快。PAGE可以根据由不同浓度的PAG控制的均匀孔径分离从5到2,000kDa的蛋白质。通常分离凝胶的浓度为5%、8%、10%、12%或15%。当我们选择适当百分比的分离凝胶时，我们应该考虑目标蛋白质的大小。已知的蛋白质重量越小，就应该使用更高百分比的凝胶。

  3.蛋白质转移

  通过凝胶电泳分离蛋白质后，蛋白质从凝胶内部转移到固体支持膜上，使蛋白质可被抗体检测到。转移蛋白质的主要方法称为电印迹，它使用垂直于凝胶表面的电场将蛋白质从凝胶中拉出并移入膜中。它可以在半干或湿条件下进行，而湿条件通常更可靠，因为它不太可能使凝胶变干。如左图所示，膜位于凝胶表面和过滤器之间。转移夹层如下形成：纤维垫（海绵）、滤纸、凝胶、膜、滤纸、纤维垫（海绵）。

  4.封闭

  封闭是Westernblot中的一个重要步骤，可以防止抗体非特异性地结合到膜上。最常用的典型封闭剂是BSA和脱脂奶粉。当膜放入蛋白质的稀溶液中时，蛋白质会附着在膜上所有目标蛋白质尚未附着的地方。这样可以减少Westernblot最终产物中的“噪音”，从而得到更清晰的结果。

  5.抗体孵育

  阻断后，将一抗与膜孵育，一抗即可与目标蛋白结合。一抗的选择取决于要检测的抗原。用抗体缓冲液冲洗膜有助于减少背景并去除未结合的抗体。冲洗膜后，将膜暴露于特异性酶标记的二抗中。进行二抗孵育时，标记的二抗可以与已与目标蛋白反应的一抗结合。根据一抗的种类，我们可以选择合适的二抗。

  6.蛋白质检测和可视化

  底物与结合到二抗上的酶发生反应，生成有色物质。它使我们能够知道目标蛋白质的密度和位置。通过将蛋白质条带与标记进行比较，可以得到大小近似值。有几种检测系统可用于蛋白质可视化，例如比色检测、化学发光检测、放射性检测和荧光检测。电化学发光(ECL)系统是最常见的检测方法。

  Westernblot通常用于定性检测蛋白质和翻译后修饰（例如磷酸化）。除此之外，它还可用于医学诊断，例如HIV检测或BSE检测。