酶联免疫吸附实验：ELISA样本处理、收集和保存

  能够应用酶联免疫吸附实验（ELISA）的样本种类比较多，有血清、血浆、细胞上清液、细胞裂解液、尿液和组织的匀浆。这些样本采集和处理方式是截然不同，了解ELISA不同样本处理、收集和保存是一门必修课。下面上海通蔚针对多年经验总结出的各类样本的采集、处理和保存方式。

  一、血清采集、处理和保存

  1.使用促凝管或分离胶促凝管采集2ml血液。

  2.室温静置30-60分钟（或更保守地2小时），直至血液完全凝固。

  3.4℃，3000rpm离心15-20分钟。

  4.小心吸取上清液（血清），分装成小份，避免产生气泡。

  5.-70℃或更低温度保存，避免反复冻融。

  8.实验使用前，室温或4℃缓慢解冻，轻轻混匀。

  ELISA实验中最常用的样本是血清。采集血液时，应使用促凝管或分离胶促凝管，并严格按照标准操作规程进行，避免溶血，因为红细胞释放的具有过氧化物酶活性的物质会干扰基于HRP的ELISA检测，导致假阳性结果。同样，应避免细菌污染，因为细菌也可能含有内源性HRP，同样会导致假阳性。

  二、血浆采集、处理和保存

  1.使用预先添加了合适抗凝剂（根据试剂盒说明书选择）的真空采血管采集血液。

  2.轻轻颠倒采血管几次，使血液与抗凝剂充分混匀。30分钟内于冰上进行后续操作。

  3.4℃，3000rpm离心10-15分钟。

  4.小心吸取上清液（血浆），分装成小份，避免产生气泡。

  5.-70℃或更低温度冻存，避免反复冻融。

  6.实验使用前，在室温或4℃缓慢解冻，轻轻混匀。

  三、尿液采集、处理和保存

  1.收集1-10mL晨尿中段，使用干净无菌的容器。

  2.4℃，3000-4000rpm离心10-15分钟。

  3.小心吸取上清液，分装成小份，避免产生气泡。可以考虑添加合适的蛋白酶抑制剂（根据具体实验需求）。

  4.-70°C或更低温度冻存，避免反复冻融。

  5.实验使用前，在室温或4°C缓慢解冻，轻轻混匀。如果出现沉淀，可以再次低速离心去除。

  四、胞上清液采集、处理和保存

  1.采集：使用无菌试管采集细胞培养上清液。

  2.离心：1000-2000g离心5-10分钟，去除细胞碎片和杂质。

  3.添加蛋白酶抑制剂(可选但推荐):根据目标蛋白选择合适的蛋白酶抑制剂。

  4.分装：将上清液分装成适合一次实验用量的小份，避免反复冻融。

  5.保存：立即置于-80℃或液氮中长期保存。短期内（例如几小时）需进行实验，可以暂时置于冰上。避免-20℃保存。

  ELISA检测：取出冻存的上清，融化后立即进行ELISA实验。避免反复冻融。

  五、细胞裂解液采集、处理和保存

  1.PBS洗涤:使用预冷的PBS洗涤细胞1-2次。

  2.加入裂解液:选择合适的裂解液，并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。裂解液的体积应根据细胞数量和培养皿大小进行调整。

  3.裂解:冰上裂解一段时间（例如30分钟），期间可以进行涡旋震荡或超声处理，以促进细胞裂解。

  4.离心:4°C下高速离心（例如12,000-15,000xg）10-20分钟，去除细胞碎片和未裂解的细胞。

  5.收集上清:小心收集上清，避免吸取沉淀。

  6.蛋白浓度测定:使用合适的蛋白浓度测定方法（例如BCA法或Bradford法）测定上清中的蛋白浓度。

  7.分装:将裂解液分装成适合一次实验用量的小份，避免反复冻融。

  8.保存:立即置于-80°C或液氮中长期保存。短期内（例如几小时）需进行实验，可以暂时置于冰上。避免-20°C保存。

  ELISA检测:取出冻存的裂解液，融化后立即进行ELISA实验。避免反复冻融。

  六、各类组织匀浆的采集、处理和保存

  1.组织准备:采集组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液和多余结缔组织，滤纸拭干，称重。

  2.选择匀浆介质和添加抑制剂:根据目标蛋白和下游应用选择合适的匀浆介质，并加入适量的蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

  3.匀浆:根据组织类型选择合适的匀浆方法。可以使用手工匀浆、机器匀浆、高压匀浆或超声波破碎等方法。匀浆过程需要在冰上或冰水浴中进行。

  4.离心:4°C下高速离心(例如10,000-15,000xg)15-30分钟，去除细胞碎片和未裂解的细胞。

  5.收集上清:小心收集上清，避免吸取沉淀。

  6.蛋白浓度测定:使用合适的蛋白浓度测定方法测定上清中的蛋白浓度。

  7.分装:将匀浆液分装成适合一次实验用量的小份，避免反复冻融。

  8.保存:立即置于-80°C或液氮中长期保存。短期内（例如几小时）需进行实验，可以暂时置于冰上。避免-20°C保存。

  ELISA检测:取出冻存的匀浆液，融化后立即进行ELISA实验。避免反复冻融。

  ELISA样本如何处理、收集和保存介绍到这里。ELISA样本处理、收集和保存是较为关键的一步，它决定下游ELISA实验成功关键。上述内容为大家起到抛砖引玉作用，除此之外可以参考自己的说明书。