ELISA如何判断实验结果的质量

  当拿到ELISA试剂盒，我们会对目标样本进行检测，对于初步实验小伙伴们，ELISA如何判断实验结果的质量？ELISA实验经常用于对复杂混合物中的特定蛋白进行检测和定量分析，结果出来后需要一定的方法来评估数据是否可靠，主要从以下几个方面评估：批内精密度、稀释线性、回收率、灵敏度（检测限）等。

  内部检测准确度

  ELISA的批内准确度是指在同一批实验（同一块酶标板、相同试剂、仪器和操作者）中，对同一样本进行多次重复测量（例如，双孔或三孔）结果的一致性。通常使用变异系数（%CV）来评估批内准确度，其计算方法为：(标准差/平均值)*100%。一般来说，%CV值越小，表示重复性越好，结果越可靠。虽然%CV小于10%通常被认为是可接受的，但具体可接受的范围取决于具体的实验要求和ELISA试剂盒的特性。

  注意：CV大的原因可能有：

  1.移液不准确。使用前请确保移液器吸头牢固地安装在移液器上，以确保吸取正确的液体量；

  2.试剂溅入其他孔中；

  3.样品或试剂被细菌或真菌污染；

  4.试剂之间交叉污染；整个酶标板的温度不一致。这可以通过将酶标板放在远离气流的恒温环境中5.孵育来避免；

  6、有些孔完全干燥。这就要求在孵育过程中微量滴定板需要始终盖上盖子。

  稀释线性

  稀释线性是指样品在经过一系列稀释后，测得的浓度值与稀释倍数呈线性关系。理想情况下，将样品稀释后，测得的浓度值应与稀释倍数成反比。例如，将样品稀释2倍，测得浓度值应为原浓度值的一半；稀释4倍，测得浓度值应为原浓度值的四分之一，以此类推。通过绘制稀释倍数和测得浓度值的曲线图，可以评估样品的稀释线性。良好的稀释线性表现为一条直线，表明在该稀释范围内，测定方法的准确性和可靠性较高。

  基质效应会影响稀释线性。当存在基质干扰时，样品稀释可以降低基质的浓度，从而减弱其对测量结果的干扰。因此，评估稀释线性也有助于判断基质效应的存在和程度。如果样品在不同稀释倍数下的测量结果偏离线性关系，则可能存在基质效应。

  回收率

  回收率用于评估样品基质对目标物质检测的影响以及方法的准确性。它是通过在样品中加入已知浓度的标准物质（加标），然后测定加标后样品中目标物质的浓度来确定的。回收率(%)=[(加标样品测定值-未加标样品测定值)/加标量]*100%。理想的回收率是100%。虽然80%-120%通常被认为是可接受的范围，但具体可接受的范围需要根据具体的实验和分析物的特性来确定。如果回收率过高或过低，说明样品基质对目标物质的检测存在干扰，例如基质抑制或基质增强效应。例如，在空白血清中加入已知浓度的IL-2，如果回收率低于预期，则提示血清中存在干扰因素，影响了抗体与IL-2的结合。

  灵敏度（检测限）

  灵敏度是指分析方法能够区分开的最低分析物水平，通常用检测限(LOD)和定量限(LOQ)来表示。

  1.空白限值(LOB):指的是在重复测量空白样品时，以一定概率（通常为95%）观察到的最大测量值。LOB反映了背景噪音的水平。

  2、检测限(LOD):指的是能够以一定置信度（通常为95%）与空白样品区分开的最低可检测分析物浓度。

  3.定量限(LOQ):指的是能够在满足预定的准确度和精密度要求的前提下，可靠定量的最低分析物浓度。LOQ通常高于LOD。

  LOD和LOQ的确定通常基于对低浓度样品和空白样品的重复测量，并结合统计学方法进行计算。它们之间的关系可以用信号与噪音的比喻来理解：LOD是信号勉强能从噪音中区分出来的水平，而LOQ是信号足够强，可以进行可靠定量的水平。

  信噪比

信噪比(Signal-to-NoiseRatio,S/N)是衡量信号强度相对于背景噪声强度的指标。在分析化学中，信噪比越高，表明分析方法的灵敏度越高，更容易区分信号和噪声。

上述是ELISA判断实验结果质量的几个指标。掌握这些实验指标，在未来进行ELISA实验来判断实验结果的好坏。