ELISA实验原理详解

  ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种利用特异性抗体（抗原）反应将目标抗原（抗体）结合在固相载体上，并利用酶标记的抗体（或抗原）进行检测，并根据显色反应的强弱来定量样品中目标物质的含量。它是一种利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，目前广泛应用生物学、医学等多种研究领域。

  ELISA实验原理

  在ELISA中，将已知的抗原或抗体结合在固相载体表面，然后利用酶标记（偶联）的抗体或抗原与之孵育，测量加入底物后形成的产物的光吸收并将其转换为数值来进行定性和定量分析。如果对定性和定量分析不是很理解，可以参考这篇文章《ELISA检测试剂盒：定性与定量分析的优势比较》。根据抗原抗体结合，该检测方法分为直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA法和竞争ELISA法等。

  直接ELISA法

  原理：将目标蛋白（或目标抗体）固定在酶标板上，与针对该目标蛋白的酶标记抗体（或针对该目标抗体的特异性抗原）一起孵育，洗涤后，测量微孔板孔结合酶的活性。

  间接ELISA法

  原理：将目标蛋白（或目标抗体）固定在酶标板上，随后分两步来进行检测，先加入检测抗体或抗原进行特异性结合。其次再加入酶标二抗检测并利用底物显色。

  夹心ELISA法

  原理：将针对目标蛋白的抗体固定在酶标板，先与目标蛋白孵育，然后与另一种用酶标记的目标蛋白特异性抗体孵育。清洗后，测量微孔板孔结合酶的活性。

  竞争ELISA法

  原理：将针对特定目的蛋白的抗体固定在酶标板，与含有目的蛋白的样品以及已知量的酶标记的目的蛋白一起孵育，反应结束后，测量微孔板孔结合酶的活性。

  当样品中的抗原水平较高时，抗体结合的酶标抗原水平较低，颜色较浅。相反，当抗原水平较低时，抗体结合的酶标抗原水平较高，颜色较深。

  上述是ELISA实验原理步介绍，上述4种ELISA法检测原理有区别，在进行ELISA实验时候，结合自己检测目标及实验需求进行选择。如果想了解更多ELISA法区别，本篇幅有限，可以参考这篇文章《酶联免疫试剂盒常见5种实验检测方法》。接下来以夹心法为列，详细介绍下ELISA实验步骤。

  1、试剂和设备的准备

  2、抗体的固定化

  将稀释后的抗体加入96孔ELISA板的每个孔中，密封板以防止蒸发，并在4°C下孵育15-18小时以固定抗体。

  3、洗涤

  除去稀释的抗体，用洗涤液洗涤3次。

  4、封闭

  向每个孔中添加封闭缓冲液，并让其在37°C下孵育1小时，以减少目标蛋白与孔的非特异性结合。

  5、洗涤

  除去封闭缓冲液，用洗涤液洗涤3次。

  6、样品添加

  用样品稀释缓冲液稀释样品，并将每个样品100µL添加到每个孔中。为制作校准曲线，在同一板上准备标准品的一系列稀释液。将其在37°C下孵育1小时。

  7、洗涤

  取出样品，用洗涤液洗涤5次。

  8、检测抗体的添加

  用样品稀释缓冲液稀释检测抗体，每孔加入100μL，

  37°C孵育1小时。

  9、洗涤

  反应结束后，去除检测抗体，用洗涤液洗涤5次。

  10、酶标二抗的添加

  用样品稀释缓冲液稀释酶标二抗，每孔加入100μL，

  37℃孵育1小时。

  11、洗涤

  反应结束后，除去二抗，用洗涤液洗涤5次。

  12、添加底物溶液。

  孵育直至颜色显现。

  13、用读板器测量450nm处的吸收率。