做ELISA实验需要注意哪些问题？注意这4个要点

  “凡事预则立，不预则废”。做ELISA实验也是如此，在进行ELISA实验时要做足充分准备。那么，在平时实验室做ELISA实验要注意哪些问题呢？下面通蔚带您从ELISA实验准备、标准品溶解、洗涤和标准线拟合及常见问题等方面进行阐述。

  ELISA操作前准备

  1、试剂盒选择。在进行ELISA操作前，应做好实验设计，并根据样本类型、物种、检测范围、灵敏度、信誉度以及成本等因素选择合适的ELISA试剂盒。同时，需要提前订购试剂盒和相关耗材，并根据说明书准备样本、稀释样品、做好充分准备工作。

  2、样本处理。样本制备是进行ELISA实验前较为关键一步。标本提倡新鲜的标本进行检测，尤其是对于当天收集的检测标本，即使暂时不用，建议分装在后在4℃保存，在4℃保存建议不要超过72小时。如需长期保存，应将标本分装成小份后放在-20℃或-70℃条件下保存。标本切记反复冻融，室温和冰箱存在一定温差，蛋白质极易降解，直接影响实验质量。

  Elisa标准品溶解

  标准品是已知浓度的代测物质，用于建立标准曲线，从而推算出未知样品中待测物质的浓度。因此标准品溶解、倍比稀释和保存等细节要特别注意。操作标准品时需格外小心，注意以下细节：

  1.复溶：根据试剂盒说明书的要求，使用正确的复溶液，并使用移液枪缓慢地将复溶液加入冻干粉中，避免产生气泡。轻轻旋转或拍打管壁，使冻干粉充分溶解。静置5-10分钟后，短暂离心，收集管壁和盖子上的液体。

  2.分装和保存：将复溶后的标准品根据一次用量分装成小份，避免反复冻融。-70℃保存更适合长期储存，-20℃则更适合短期储存(具体储存温度和时间请参考试剂盒说明书)。

  3.稀释：准备干净的离心管并进行编号，根据试剂盒说明书选择合适的稀释液。在独立的管子中进行系列稀释，避免在ELISA板内进行过多的倍比稀释步骤。稀释时，使用移液枪准确吸取，并轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡。建议使用进口或硅化的EP管，以减少蛋白质吸附。

  4.加入到ELISA板中：使用移液枪将稀释好的标准品加入到ELISA板的相应孔中，注意枪头不要刮划孔底。

  5.稳定性：标准品复溶后的稳定性取决于具体的试剂盒，请仔细阅读试剂盒说明书，并在规定的时间内使用。

  ELISA操作中的洗涤

  洗涤是ELISA操作步骤中至关重要，如果洗涤不当，会导致背景值高、假阳性结果以及实验重复性差等问题。 因此，必须严格按照试剂盒说明书规定的步骤、体积、时间和次数进行洗涤操作，例如使用多道加样器、吸管或洗板机等。下面通蔚为大家整理一些洗板小贴士，大家可以对照了解自己洗板操作是否正确。

  1、洗涤液不要溢出孔。在ELISA洗涤过程，洗涤液溢出孔容易交叉污染相邻的孔，容易造成背景高，从而影响实验准确性，尤其是在前两次洗涤时，由于孔中残留的未结合的抗体或抗原浓度较高，溢出后更容易污染相邻孔，导致假阳性信号。

  2、设置实验考虑孔位置。为了减少潜在的交叉污染，建议将空白孔、低浓度标准品孔和阴性对照组放置在ELISA板的边缘或单独的区域。这样可以尽量避免这些孔受到高浓度样本或标准品的影响。

  正确的甩板方式对于减少交叉污染至关重要。甩板时，应将ELISA板倾斜，使液体流向一侧，然后在干净的吸水纸上轻拍，以吸干残留液体。避免旋转甩板，因为这样容易造成液体残留和飞溅，增加交叉污染的风险。轻微的抖动可以帮助去除残留液体，但要确保液体不会飞溅到其他孔中。

  除了孔位置和甩板方式外，其他操作步骤也可能导致交叉污染。例如，加样时应避免枪头接触孔壁，洗涤时应避免洗涤液溢出。应严格按照试剂盒说明书进行操作，并采取必要的预防措施，以最大程度地减少交叉污染的风险。最终的孔设置请参考所用试剂盒的说明书。

  3、用干净的滤纸，不要用卫生纸。ELISA洗板后，拍干残留液体是至关重要的步骤。为了避免污染和干扰实验结果，强烈建议使用干净的无尘纸或专用ELISA板吸水纸，而不是普通的卫生纸。

  4、卫生纸通常含有细小的纤维和粉尘，这些物质容易脱落并粘附到孔中。这些污染物会干扰后续的反应，导致背景值升高或吸附待测物质，从而导致结果偏低或不准确。此外，卫生纸的吸水性也可能不如无尘纸或专用吸水纸，导致液体残留，影响实验结果的重复性。

  5、正确的拍干方式是将ELISA板倒扣在干净的吸水纸上，并轻轻拍打板底，确保每个孔都充分接触吸水纸，以吸干残留液体。避免重复使用吸水纸，以防止交叉污染。使用干净且合适的吸水材料对于确保ELISA实验结果的准确性和可靠性至关重要。

  ELISA标准曲线拟合

  ELISA标准曲线拟合是ELISA实验数据分析的关键步骤。一般情况下，应优先按照试剂盒说明书推荐的拟合方法进行操作。虽然部分酶标仪可自动生成标准曲线，也可手动制作，但推荐使用酶标仪配套软件或专业数据处理软件进行拟合，以提高效率和减少人为误差。

  ELISA标准曲线通常呈“S”形，两端趋于水平，中间近似线性。中间的线性部分是最佳检测范围，灵敏度和准确度最高。由于抗原抗体反应的饱和效应，当标准品浓度超过一定值后，即使继续增加浓度，OD值也不再显著变化，曲线趋于水平。厂商提供的推荐浓度范围通常落在近似线性区域，但不一定完全在S形的正中间。

  根据标准曲线，可以计算待测样本的浓度。然而，如果数据中存在“奇异点”（偏离整体趋势的异常数据点）或“污点”（由于操作误差，例如加样错误、污染等导致的无效数据点），直接进行线性拟合或其他拟合可能会导致结果不准确。出现这种情况时，需要仔细检查实验操作，找出异常值出现的原因。如果确定是操作误差导致的“污点”，则可以剔除该数据点；如果是由于其他原因导致的“奇异点”，则需要谨慎考虑是否剔除，并根据具体情况选择合适的处理方法。

  除了线性拟合，还可以采用其他拟合方法，例如双对数拟合和四参数逻辑回归(4PL)拟合。4PL拟合通常是ELISA数据处理中最常用的非线性拟合方法，因为它能更准确地描述S形曲线，尤其是在曲线两端非线性较强的情况下。一些软件还允许使用不同的权重，例如1/Y或1/Y²加权，以提高低浓度区域的拟合精度。选择哪种拟合方法以及是否使用权重，需要根据试剂盒说明书、数据的特点和分析目的进行判断。

  上述是做ELISA实验要注意的问题，掌握上述ELISA注意事项，保证ELISA实验顺利进行至关重要。希望本文指导可以帮助您在未来实验中取得成功。