ELISA 实验过程中的常见问题及解决

  上篇文章为大家介绍了《ELISA是什么？它能检测出什么？》。相信大家对ELISA应用有所了解，不过在ELISA实验中难免会出现问题，今天为大家介绍一下ELISA实验中常见的问题以及对遇到问题的解决办法。

  ELISA原理之前文章中有阐述，这里再简要概述一下，了解ELISA原理有助于应对实验遇到问题。

  Elisa的原理

  通过抗原与抗体的特异性免疫反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗原也可以是抗体。

  在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化水解或氧化还原反应而成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

  所生成有色产物的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。

  Elisa对照

  每次进行ELISA时都应进行对照，以确保实验的准确性。常见的对照包括阳性和阴性对照、空白孔和质量控制样品。阳性对照含有已知量的目标抗原，而阴性对照则不含。空白孔不含样品或试剂，用于测量背景信号。质量控制样品用于验证检测的准确度和精密度。

  Elisa问题和解决方案

  空白（B）

  ELISA中使用空白对照孔（B）是为了控制板本身的变异，这些孔不接触任何样本或检测抗体。如果空白孔的OD值升高，可能表明洗板存在问题，需要进一步调查。常见原因包括洗板机故障、底物过量或其他因素。

  零浓度(ZC)

  ELISA中的零浓度对照(ZC)与空白对照(B)类似，但包括检测中使用的所有缓冲液和试剂，但不包含目标抗原。它可以帮助确定检测的背景信号，对于计算真正的检测限(LOD)至关重要。在实验运行过程中，ZC的OD值应该保持稳定，如果出现明显变化，需要调查原因，例如洗板机故障、试剂问题或其他因素。定期检查ZC对照的OD值，并及时排查问题，可以确保实验结果的准确性。

  非特异性结合(NSB)

  NSB对照是ELISA中的另一种对照，它可以评估检测抗体（标记抗体）对总OD信号的非特异性贡献。在NSB对照中，通常不添加特异性抗原或样品，而是仅将ELISA板与标记抗体和必要的缓冲液（如阻断缓冲液）孵育。有时，还会采用增强的洗涤步骤来进一步减少非特异性结合。通过这种方式，NSB对照能够区分由特异性抗原-抗体结合产生的信号与由非特异性因素（如标记抗体与ELISA板表面的非特异性吸附）产生的背景信号，从而提高实验结果的准确性和可靠性。NSB对照的预期OD值应该略高于空白对照(B)孔，但低于零浓度对照(ZC)孔。如果NSB孔的OD值明显高于预期，则可能表明标记抗体存在非特异性结合、封闭不充分或其他因素。正确的试剂制备和输送对NSB对照和整个实验结果的准确性至关重要。

  最大结合(MaxBinding)对照

  最大结合对照用于估计检测所能产生的最大信号。它通过将过量的抗原或标准品加入到微孔板中，确保所有捕获抗体都被结合，从而确定信号的上限。最大结合对照对于计算样本的结合百分比、识别样本、底物或检测抗体的问题至关重要。

  通蔚建议

  Elisa实验结果不一致或不准确的结果可能是由于各种因素造成的，例如试剂使用不当、孵育不均匀、移液技术不正确、交叉污染以及ELISA试剂盒质量低劣。为了确保ELISA实验结果的一致性和准确性，建议注意以下几个方面：

  1.试剂管理:

  使用新鲜、适当稀释的试剂，并在移液到板上之前充分混合。

  选择黑值低、吸附性好的优质ELISA试剂盒。

  定期校准仪器，并使用标准品进行质量控制。

  2.操作步骤:

  孵育期间使用板密封剂，并避光孵育底物。

  使用移液器时，每次移液前都应更换枪头，并且不要让移液器接触孔底，以避免交叉污染。

  确保孵育温度均匀，避免培养皿堆叠。

  严格按照实验步骤进行操作，并记录实验过程。

  3.环境控制:

  避免阳光直射，避免温度和湿度剧烈变化。

  保持工作区域清洁，防止污染。

  4.试剂盒质量检测:

  空白对照(B)和零浓度对照(ZC):评估试剂盒的背景信号和检测限。

  最大结合对照(MaxBinding):评估试剂盒的灵敏度和饱和度。

  标准品:使用标准品验证试剂盒的准确性和精密度。

  重复性:进行多次重复实验，验证试剂盒的结果重复性。

  最后，ELISA实验过程遵循良好的实验室规范，注意细节，并使用适当的试剂处理和储存，有助于在ELISA实验中获得准确和一致的结果。