ELISA实验操作相对简单，易于标准化和自动化，不过难免也会出现一些问题。常见问题包括标准曲线不佳、无信号、变异系数（CV）及背景高问题。这些问题将会影响实验结果的准确性。本文针对这些问题，为大家详细的介绍。
目录：
1）标准曲线不佳
2）无信号
3）变异系数（CV）高
4）背景高
一、标准曲线不佳
标准曲线至关重要，因为它可以让您确定样品中目标分子的浓度。如果您的标准曲线不正确，可能并不总是很明显，因此建立对它的信心是第一步。我们强烈建议您在每次进行ELISA时使用或准备质量控制(QC)样品。理想情况下，这些样品应涵盖低、中、高浓度，覆盖标准曲线的整个范围。将它们放在ELISA板的左侧和右侧（第1列和第12列）。这些QC样品的浓度应与标准曲线上的浓度不同，模拟已知浓度的实际样品以进行准确性验证。理想情况下，将QC样品基质与您的真实样品（例如血清或血浆）相匹配。还建议提前准备一批QC样品并将其储存在-80°C下，就像您的常规样品一样。这样，您就可以监控一段时间内或不同生产批次的检测性能，前提是您的分析物在您的存储条件下保持稳定。如果您预计未来需要新的QC样品，请在用完旧批次之前准备好它们，这样您就可以在测试检测中同时运行旧批次和新批次，以确保等效性。
标准曲线常见问题
标准曲线的常见问题可能包括不同浓度下的光密度(OD)值不一致，导致曲线拟合度较差且R²值较低（理想情况下，R2应>0.99）。
|
常见问题
|
解决方案
|
|
1.标准溶液不正确：使用错误浓度的标准起始溶液可能会导致标准稀释不足或过度稀释，从而导致 OD 偏差并使标准曲线超出范围。
|
仔细检查标准储备液浓度、稀释计算和稀释度。如果您要从冻干小瓶中重构标准品，请确保遵循厂家的说明。建议涡旋小瓶以确保完全重构。
|
|
2.降解标准：旧的或储存不当的标准可能已经降解，导致 OD 值低于未降解的标准。
|
验证标准是否已正确配制并适当存储。
|
|
3.曲线不符合比例：有时，即使您认为曲线绘制正确，您仍可能观察到比平时更高或更低的 OD 值。这可能是由于检测试剂批次不同等因素导致吸光度变化。
|
首次使用特定厂家的 ELISA 试剂盒时，请确保使用推荐的曲线拟合模型，通常是 4 或 5 参数逻辑曲线拟合模型 (4-PL 或 5-PL)。如有必要，请尝试其他曲线拟合模型，如对数-对数。一致性是关键，因此更改曲线拟合模型可能会导致您的结果在检测之间无法比较，尤其是在需要绝对值的情况下。
|
|
4.移液误差：向板中添加样品时可能会发生移液误差，例如样品量不正确或变异系数 (CV) 过高。
|
为了最大限度地减少移液错误，请确保移液器吸头牢固连接，在试剂和样品之间更换吸头，消除孔或移液器吸头中的气泡，将试剂/样品分配到孔的侧面，并通过连续的抽吸/分配循环冲洗吸头。
|
温馨提示：保留您的试管，直到您分析了结果。保留用于制备标准品、QC样品和样品的试管，可以让您在稍后发现错误时仔细检查稀释错误或试管混淆。
二、无信号
让我们来探讨一下ELISA结果中信号缺失或非常弱的原因和可能的解决方案。由于ELISA中的每个步骤都至关重要，信号缺失的潜在原因有很多，因此故障排除是一个综合过程。
|
常见问题
|
解决方案
|
|
1.无样品信号，但标准品和/或 QC 样品良好
|
1.如果您的标准/校准曲线和/或QC样品显示信号，但您的样品没有（如预期），则您的样品可能有问题。可能出现以下几种问题：
2.使用新的样本基质：并非所有ELISA都适用于所有样本类型，使用不同样本类型可能需要咨询厂家或重新开发检测方法。
3.稀释度过高：样品过度稀释超过ELISA的灵敏度可能会导致信号丢失。
4.分析物低于检测限：样本中可能含有分析物不足，低于ELISA的检测限。
5.降解样本
|
|
零信号
|
有多种潜在原因可导致零信号产生：
1.孵育时间/温度：验证孵育时间和温度是否符合制厂家的说明要求，以避免影响检测动力学。
2.捕获/检测抗体不足/不正确：仔细检查抗体稀释度，特别是内部制备的试剂，并确保正确订购厂家提供的即用型试剂。
3.添加的捕获/检测试剂不足：确保向板中添加了正确量的试剂。
4.读取器波长：确认您的平板读取器上的波长设置正确，特别是在使用需要视觉停止的底物时。
5.底物溶液：使用正确的底物并检查储备溶液的有效期。
6.洗板：避免过度剧烈或长时间洗板，因为这可能会洗掉分析物或试剂。
7.干燥孔：防止孔变干，以避免出现不可预测的ELISA问题。
|
三、变异系数（CV）高
让我们深入探讨ELISA结果中变异系数(CV)较高的可能原因。高CV可能表现为重复孔之间的光密度读数存在显著差异，并且可能对板的某些部分产生不同的影响。解决问题取决于确定高CV的具体位置，因为它会影响曲线拟合和结果可靠性。
|
常见问题
|
解决方案
|
|
移液误差
|
虽然通常归因于移液误差，但高 CV 也可能由样品制备、试剂处理和清洗步骤中的错误造成。确保稀释样品混合正确，以避免重复样品之间存在差异。
|
|
样品准备
|
将稀释样品加入板中之前，大力混合或用移液器吸出稀释样品，以避免分析物分布不一致。
|
|
试剂准备
|
试剂（如捕获抗体或检测抗体）混合不当可能会导致不同孔中的试剂水平不同，从而增加 CV。
|
|
洗板
|
确保彻底、一致地洗板，以防止板上残留基质成分，导致背景信号增加。
|
|
孔内气泡
|
移液时尽量减少气泡，因为气泡会干扰分析物或试剂。读取板前应消除所有可见气泡。
|
|
边缘效应
|
注意边缘效应，这可能是由于板上的温度差异造成的。控制温度并确保适当的试剂混合可以缓解此问题。
|
四、高背景
ELISA中的高背景表现为整个板的颜色显色或光密度读数过高。高背景会增加信噪比，降低检测灵敏度并可能导致结果不可用。高背景通常有两个主要原因：板清洗和板阻塞。但是，我们将在下面更详细地讨论。
温馨提示：如果您在一段时间内进行大量相同的ELISA，请将空白（阴性对照）、标准和任何QC样品孔的光密度制成表格。这可以让您了解检测或试剂是否随时间而变化，从而导致检测动力学逐渐发生变化。
|
常见问题
|
解决方案
|
|
基于抗体的问题
|
1.包被/检测抗体浓度：仔细检查捕获抗体的稀释度，特别是如果您从头开始开发ELISA。在这种情况下，可能需要优化包被条件。
2.非特异性结合：检查抗体的配方，确保所用的稀释剂合适，因为不兼容的稀释剂会导致非特异性结合。充分的板封闭对于减少非特异性结合至关重要。
3.交叉反应性：当使用新新批次、新供应商或新类型的抗体时，请使用阴性对照检查是否与样品类型中的其他分析物发生交叉反应。
|
|
试剂（缓冲液或底物）
|
由于之前的背景较高而重复检测时，请始终使用新鲜试剂。受污染的缓冲液可能导致背景较高。
|
|
基质效应
|
术语“基质效应”是指非目标样品基质成分产生的信号干扰。它是指最终测定读数中“所有”样品成分总和所观察到的信号增加。某些基质对最终测定信号的影响大于其他基质。请咨询厂家以获取有关基于试剂盒的测定的经过验证的样品类型的信息，或者如果您自己开发了新的样品类型，请针对新样品类型优化您的测定。
通过加标和回收实验，您可以评估样品基质对特定测定的影响，这在使用组分试剂而非预格式化试剂盒开发ELISA时尤为重要。将已知量的分析物添加到样品基质和用于制备标准的稀释剂中。然后应使用两种样品类型完成ELISA并根据标准曲线计算响应，从而确定测定中的基质效应。
如果观察到明显的基质效应，则用与样品更接近的基质（例如细胞裂解缓冲液或血清）稀释标准品。
|
|
封闭
|
封闭缓冲液在检测中至关重要，因为它可以防止非特异性结合。为了降低高背景，请考虑增加封闭溶液的浓度或添加少量非离子洗涤剂，例如Tween-20。延长封闭步骤的孵育时间和使用平板振荡器也有帮助。
|
|
洗板
|
洗板不充分会导致基质成分残留在板上，从而导致背景信号增加。清洗步骤或在清洗步骤之间进行短暂孵育可有效降低背景。确保自动洗板机正常运行，并且在更换清洗缓冲液之间管路清洁且冲洗干净。
|
|
基底问题
|
如果反应未在规定时间内停止，某些底物（如TMB）可能会沉淀。请遵循制造商的建议，并在加入终止液后立即读取板。确保检测板底部清洁，以防止干扰板读取器。
|
购物车
021-54845833/15800441009