ELISA 技巧|做ELISA实验需要注意哪些问题？

常见问题

解决方案

1.标准溶液不正确：使用错误浓度的标准起始溶液可能会导致标准稀释不足或过度稀释，从而导致 OD 偏差并使标准曲线超出范围。

仔细检查标准储备液浓度、稀释计算和稀释度。如果您要从冻干小瓶中重构标准品，请确保遵循厂家的说明。建议涡旋小瓶以确保完全重构。

2.降解标准：旧的或储存不当的标准可能已经降解，导致 OD 值低于未降解的标准。

验证标准是否已正确配制并适当存储。

3.曲线不符合比例：有时，即使您认为曲线绘制正确，您仍可能观察到比平时更高或更低的 OD 值。这可能是由于检测试剂批次不同等因素导致吸光度变化。

首次使用特定厂家的 ELISA 试剂盒时，请确保使用推荐的曲线拟合模型，通常是 4 或 5 参数逻辑曲线拟合模型 (4-PL 或 5-PL)。如有必要，请尝试其他曲线拟合模型，如对数-对数。一致性是关键，因此更改曲线拟合模型可能会导致您的结果在检测之间无法比较，尤其是在需要绝对值的情况下。

4.移液误差：向板中添加样品时可能会发生移液误差，例如样品量不正确或变异系数 (CV) 过高。

为了最大限度地减少移液错误，请确保移液器吸头牢固连接，在试剂和样品之间更换吸头，消除孔或移液器吸头中的气泡，将试剂/样品分配到孔的侧面，并通过连续的抽吸/分配循环冲洗吸头。

常见问题

解决方案

1.无样品信号，但标准品和/或 QC 样品良好

1.如果您的标准/校准曲线和/或QC样品显示信号，但您的样品没有（如预期），则您的样品可能有问题。可能出现以下几种问题：

2.使用新的样本基质：并非所有ELISA都适用于所有样本类型，使用不同样本类型可能需要咨询厂家或重新开发检测方法。

3.稀释度过高：样品过度稀释超过ELISA的灵敏度可能会导致信号丢失。

4.分析物低于检测限：样本中可能含有分析物不足，低于ELISA的检测限。

5.降解样本

零信号

有多种潜在原因可导致零信号产生：

1.孵育时间/温度：验证孵育时间和温度是否符合制厂家的说明要求，以避免影响检测动力学。

2.捕获/检测抗体不足/不正确：仔细检查抗体稀释度，特别是内部制备的试剂，并确保正确订购厂家提供的即用型试剂。

3.添加的捕获/检测试剂不足：确保向板中添加了正确量的试剂。

4.读取器波长：确认您的平板读取器上的波长设置正确，特别是在使用需要视觉停止的底物时。

5.底物溶液：使用正确的底物并检查储备溶液的有效期。

6.洗板：避免过度剧烈或长时间洗板，因为这可能会洗掉分析物或试剂。

7.干燥孔：防止孔变干，以避免出现不可预测的ELISA问题。

常见问题

解决方案

移液误差

虽然通常归因于移液误差，但高 CV 也可能由样品制备、试剂处理和清洗步骤中的错误造成。确保稀释样品混合正确，以避免重复样品之间存在差异。

样品准备

将稀释样品加入板中之前，大力混合或用移液器吸出稀释样品，以避免分析物分布不一致。

试剂准备

试剂（如捕获抗体或检测抗体）混合不当可能会导致不同孔中的试剂水平不同，从而增加 CV。

洗板

确保彻底、一致地洗板，以防止板上残留基质成分，导致背景信号增加。

孔内气泡

移液时尽量减少气泡，因为气泡会干扰分析物或试剂。读取板前应消除所有可见气泡。

边缘效应

注意边缘效应，这可能是由于板上的温度差异造成的。控制温度并确保适当的试剂混合可以缓解此问题。