ELISA实验操作要点：固体样本处理方法

固体样本处理方法：

固体样本处理原则：称取1g的固体样本，用9g的合适缓冲液溶解，分泌蛋白可以直接离心取上清检测，细胞内的蛋白，要先收集细胞，再用合适方法破碎，离心取上清测试。

1、组织标本：
2、切割标本后，称取1g组织，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。对于植物组织，不好匀浆的话，就用液氮研磨，将植物组织放在研钵中，加入适量液氮，充分研磨。

2、细胞内蛋白样本：
许多待测蛋白不是分泌蛋白，而是存在于细胞内的蛋白，这个时候，要先收集细胞，洗涤干净，再破碎细胞，离心取上清。

（1）培养的细胞
A、动物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融（如果反复冻融，破碎效果不好，就采用超声波破碎），以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
B、植物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/ml左右，置于冰盒上，用超声破碎仪，设置破碎2s，冷却30s的方式，充分破碎细胞，以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

（2）组织的细胞
切割标本后，称取1g组织，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗涤沉淀的细胞三遍。再用上述的细胞破碎方法破碎细胞。

3、土壤：称取1g土壤，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工将标本充分混匀。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。如果是测分泌蛋白，直接取上清检测，测试细胞内蛋白，要破碎细胞。

4、咽拭子：加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS，溶解咽拭子头部，摇匀，用镊子取出咽拭子并挤干液体，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。如果是测分泌蛋白，直接取上清检测，测试细胞内蛋白，要破碎细胞。

5、植物标本的采集及保存
1、 称取0.1g（误差±3%以内）新鲜植物组织样本，在液氮中充分研磨；
2、 加入1ml的提取液（80%甲醇）, 置于-20度过夜；
3、 于4度，8000rpm，离心1小时，取上清；
4、 上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。过柱后的样本真空干燥或氮气吹干，保存备用；
5、 上样前加入pH7.4 PBS缓冲液（1ml定容）。混匀后室温放置30分钟，然后4度离心（8000rpm，15分钟），取上清并暂时保存于4度待用。

样本收集注意事项
1、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
2、标本采集后尽快进行实验，若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。