ELISA样本处理？不同类型ELISA样本处理方法比较

  ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于量化样本中目标靶标的技术。常见样本包括血液（血清和血浆）、组织匀浆、细胞裂解物和细胞培养上清液。ELISA获得的结果可能受到样本的收集、处理和储存方式的影响。本问为您介绍ELISA样本处理方法。

  目录：

  血液

  组织匀浆

  细胞裂解物

  细胞培养上清液

  一、血液

  全血样本含有多种成分。主要成分是血细胞（红细胞、白细胞和血小板）和血液的液体成分。全血可以离心，使血细胞与血液分离。根据血液的制备方式，所得液体将是血清或血浆。

  血清

  血清是血液中不含血细胞或凝血因子的成分。它本质上与血浆相同，但不含纤维蛋白原。凝固的血液会产生不含纤维蛋白原的血清，但可能残留一些凝血因子。

  制备方案：

  1.使用血清分离管收集血清，在室温下静置1-2小时或在4°C下静置过夜。

  注意：血液样本静置后会自然凝结；温度越低，凝结过程越慢。

  2.以1000×g的速度离心20分钟。

  3.将上清液转移到干净的试管中并立即分析或储存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一个月）或-80°C（最多两个月）下。避免反复冻融。在进行分析前将样品恢复至室温。

  血浆

  血浆是血液的一种成分，构成血细胞（红细胞、白细胞和血小板）周围的细胞外基质。抗凝（未凝固）的血液会产生血浆，其中包括纤维蛋白原和凝血因子。如果目标分析物是凝血因子，建议使用血浆作为样品类型，而不是血清。

  血浆样本需要抗凝。抗凝剂的选择取决于目标分析物。通常使用2%EDTA、1%肝素或3.8%柠檬酸钠。应避免溶血，因为这会释放蛋白酶，从而导致样本中存在的目标分析物降解。高脂质浓度会导致溶血，因此也应避免。

  制备方案：

  1.将血浆收集到含有所需抗凝剂的试管中。

  2.收集后30分钟内，在2-8°C下以1000×g离心15分钟。

  3.将上清液转移到干净的试管中并立即分析或储存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一个月）或-80°C（最多两个月）下。避免反复冻融。在进行分析前将样品恢复至室温。

  柠檬酸钠

  血液中的Ca2+通过钙依赖性凝血途径促进凝血。柠檬酸钠螯合游离Ca2+离子，抑制这些途径，从而防止凝血。

  优点：适用于大多数情况，不影响凝血因子。

  缺点：抗凝作用弱，溶解性差。

  建议用法：柠檬酸钠（109mmol/L）：血液比例为1：9；或柠檬酸钠（106mmol/L）：血液比例为1：4。

  乙二胺四乙酸

  血液中的Ca2+通过钙依赖性凝血途径促进凝血。乙二胺四乙酸(EDTA)螯合游离的Ca2+离子，使其不再处于游离状态，从而阻止凝血。

  优点：适用于大多数情况，不影响红细胞或白细胞。

  缺点：影响血小板聚集，不适合检测凝血或血小板因子。

  建议使用方法：EDTA（15g/L）：血液比例为1:10

  肝素

  抗凝血酶III是一种抑制凝血途径中多种酶（主要是丝氨酸蛋白酶）的蛋白质。肝素与抗凝血酶III结合，将其激活，导致抗凝血酶III活性增加，从而增强抗凝血作用。

  优点：抗凝效果强，不改变血细胞体积，高温下稳定，不易溶血。

  缺点：引起白细胞聚集，抗凝效果短暂。

  建议用法：肝素（1g/L）：血液比例为1:10。

  二、组织匀浆

  组织匀浆的实验方案取决于用作样本的确切组织。可能需要添加蛋白酶抑制剂以防止目标分析物降解。一些组织样本（如肝脏、肾脏、脑组织）可能会产生假阳性结果，因为内源性生物素会与亲和素和链霉亲和素相互作用。

  制备方案：

  1.用冰冷的PBS冲洗组织以去除多余的血液。在均质化之前称量组织。

  2.将组织切碎，在冰上用组织匀浆器在PBS中匀浆，并对细胞悬浮液进行超声处理。

  3.以5000×g的速度离心5分钟，以去除所有沉淀物。

  4.将上清液转移到干净的试管中并立即分析或储存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一个月）或-80°C（最多两个月）下。避免反复冻融。在进行分析前将样品恢复至室温。

  三、细胞裂解物

  细胞必须先裂解才能进行ELISA检测。细胞裂解可通过物理方法（如超声波或冻融循环）或化学方法（如RIPA、TritonX-100、NP-40、SDS、脱氧胆酸钠、β-巯基乙醇、DTT、尿素）诱导。通常，物理方法优于化学方法，因为化学洗涤剂会影响ELISA获得的结果。建议使用1%浓度的TritonX-100和1%NP-40，因为这足以裂解细胞，同时对ELISA吸光度值没有或几乎没有明显影响。

  建议方案：

  1.用胰蛋白酶分离贴壁细胞，然后离心并收集上清液。对于悬浮细胞，离心并收集上清液。

  2.用冰冷的PBS清洗细胞三次，然后用PBS重新悬浮。

  3.用超声波裂解细胞四次。或者，将样品冻融（-20°C至室温）三次。

  5.在2-8°C下以1500×g离心10分钟，以去除任何细胞碎片。

  将上清液转移到干净的试管中并立即分析或储存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一个月）或-80°C（最多两个月）下。避免反复冻融。在进行分析前将样品恢复至室温。

  四、细胞培养上清液

  如果目标分析物是分泌蛋白，则建议使用细胞培养上清液作为样品类型。

  制备方案：

  1.以1000×g的速度离心20分钟，以去除所有沉淀物。

  2.将上清液转移到干净的试管中并立即分析或储存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一个月）或-80°C（最多两个月）下。避免反复冻融。在进行分析前将样品恢复至室温。

  上述为大家介绍了常见ELISA样本处理，正确的样本处理有助于提高ELISA实验的准确性。除了常见的样本制备之外，根据目标分析物，可以测试其他样本，例如皮肤、尿液、粪便、支气管肺泡灌洗液、胸膜液、唾液、脑脊液等。本篇篇幅有限，下次详细介绍。