ELISA样本如何处理、收集、保存
发布时间：2024-10-31 发布作者：上海通蔚生物
ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种快速、灵敏、准确可靠的一种定量分析方法，样本收集、处理及保存对ELISA实验起着关键作用。利用ELISA进行检测的样本类型包括血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清等。这些样本收集的时间、处理方法和保存都会影响到ELISA实验的结果。下面是通蔚生物为大家详细介绍常见的样本收集、处理和保存方法。
目录：
1、ELISA样本制备技巧
2、ELISA常见样本收集、处理
3、ELISA样本保存
ELISA样本制备技巧
1.采集血液样本时应尽量避免发生溶血。
2.采集抗凝全血后，应轻轻倒置管子，确保充分抗凝，防止部分血液未与抗凝剂接触而引起凝血。
3.收集组织和细胞提取物样本时，不建议使用市售裂解缓冲液。裂解缓冲液中的表面活性剂可能会影响分析物的天然构象，从而可能导致测量值显著降低或出现假阴性。此外，由于引入了新溶剂，潜在的基质干扰不确定，这可能会增加背景水平并影响测量准确性。
4.避免使用高脂血症样本。高脂样本含有脂质，且并非均质溶液，若直接上样，可能会干扰抗原抗体结合，从而影响测定准确性。
5.如果样品需要在一周内检测，请将其保存在2-8°C下。如果不能及时进行检测，请根据使用量分装样品，并将其保存在-20°C或-80°C下，以避免反复冻融循环。血清、血浆、细胞和组织提取物通常用结合缓冲液稀释50%。
6.匀浆中总蛋白浓度至少应为1mg/mL，最好为2mg/mL以上。
7.采集的样本可保存不同期限：48小时（2-8℃），1个月（-20℃）或6个月（-70℃）。
8.裂解物的蛋白质浓度可以通过不受洗涤剂抑制的总蛋白质测定法（如二辛可宁酸(BCA)测定法）来确定。每个样品的体积也可以标准化，以便每次测定提供相同量的总蛋白质。
ELISA常见样本收集、处理
血清
-
将全血收集到不含添加剂的试管中。
-
-
将血液在室温下保存30分钟。
-
-
以3,000rpm和4°C离心10分钟。
-
-
立即测定或分装上清液（血清）并保存在-80°C（避免冻融循环）。
注意：采集血清样本时应避免溶血。发生溶血的样本可能会增加HRP偶联ELISA检测中的非特异性染色。此外，还要避免细菌污染，因为细菌体中含有内源性HRP，也会产生假阳性。血清标本易在新鲜时检测，如在冰箱中保存过久，其中可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。
血浆
-
用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本。
-
-
30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染。
-
-
将采集血液用离心机4℃，2500rpm离心5min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。
-
-
取上清，分装冻存储备
注意事项：制备血浆标本要借助抗凝剂EDTA，抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。
组织匀浆
用PBS冲洗组织以去除多余的血液。
将组织在冰冷缓冲液中切成1-2毫米的碎片，放在冰上立即均质化或在-80°C下保存以供稍后使用。
准备提取缓冲液。可以提前配制并储存在4°C下。
1)、100mMTris，pH7.4
2)、150毫米氯化钠
3）、1毫米EGTA
4）、1毫米EDTA
5）、1%TritonX-100
6）、0.5%脱氧胆酸钠
使用前，必须立即向提取缓冲液中添加以下物质，以生成完整的提取缓冲液。
1）、磷酸酶抑制剂混合物
2）、蛋白酶抑制剂混合物
3）、PMSF（苯甲基磺酰氟）至1mM
对于每0.1毫克组织，向管中添加500μL完全提取缓冲液并均质化。
用500μL提取缓冲液冲洗均质机刀片2次。
将样品放在4°C的振荡器上摇动1小时。
将样品以约10000Xg的速度离心5分钟。
立即测定或分装上清液（可溶性蛋白质提取物）并保持在-80°C（避免冻融循环）。
细胞裂解物
收集细胞并用PBS冲洗。
在裂解缓冲液（例如哺乳动物细胞蛋白提取试剂，Boster目录编号：AR0103）中彻底均质化并裂解细胞。
将细胞裂解物在约10,000xg和4°C下离心5分钟。
立即测定或分装上清液并保存在-80°C（避免冻融循环）。
细胞培养上清液
将细胞培养基以1,500rpm和4°C的速度离心10分钟。
立即测定或分装上清液并保存在-80°C（避免冻融循环）。
等离子体
将全血收集到含有抗凝剂的试管中（不同的蛋白质可能需要不同的抗凝剂，有关抗凝剂用途的详细信息，请参阅数据表）。
以3,000rpm和4°C离心10分钟。
立即测定或分装上清液（血浆）并保存在-80°C（避免冻融循环）。
尿
将尿液收集到无菌或一次性容器中（新鲜尿液样本必须立即使用或保存，以避免产生内源性HRP的细菌繁殖，从而产生潜在的假阳性结果）。
将样品以10,000xg的速度离心1分钟。
立即测定或分装上清液并保存在-80°C下。（避免反复冻融）。
唾液
使用不具备任何蛋白质结合或过滤功能的收集装置（例如Salivette）收集唾液。
以10,000xg和4°C离心2分钟。
立即测定或分装上清液并保存在-80°C（避免冻融循环）。
牛奶
在1500xg和4°C下离心15分钟。
收集水性部分并重复此过程3次。
通过0.2µm过滤器过滤。
立即测定或分装上清液并保存在-80°C（避免冻融循环）。
ELISA样本保存
①样本收集后如在一周内检测，可置于4℃保存；
②若不能及时检测，请按一次使用量进行小份分装，置于-20℃（1个月内检测）或-80℃（半年内检测）保存，避免反复冻融。
③还应保证样本不含NaN3，因为NaN3会抑制HRP的活性，从而导致假阴性结果出现。
导致样本溶血的原因及如何避免
在样本处理中，溶血是指红细胞破裂，释放血红蛋白到血清或血浆中。溶血可由各种物理、化学和毒性因素引起。体外，机械搅拌或低温冷冻可导致溶血。
发生溶血后，内源性HRP酶和血红蛋白的过氧化物酶样活性会导致ELISA中不受控制的非特异性染色，影响结果的准确性。如果样本发生轻微溶血，建议在与标准品孵育后洗板1-3次，以尽量减少干扰。如果发生严重溶血，建议收集新的样本。
为避免溶血影响检测结果，请确保静脉穿刺压力不要过高，避免采血量过少，采血时动作轻柔，避免剧烈摇晃，离心速度不要过高，采得的全血应及时处理成血清/血浆，避免全血冻融。如果采血时需要麻醉，请使用不会引起溶血的麻醉剂。
购物车
021-54845833/15800441009