避免实验误区：ELISA 试剂盒使用方法及注意事项

  ELISA试剂盒又叫“酶联免疫试剂盒，”在生物实验，是一种高敏感、特异性强，重复性好等检测优势广泛应用在免疫学检验各个领域中。对于ELISA试剂盒使用，有些科研小伙伴们有些不解，今天由上海通蔚生物为大家介绍一下ELISA试剂盒使用方法。我们从实验前准备、实验步骤和结果分析及注意事项加以说明。

  1、试验前准备

  2、实验步骤

  4、注意事项

图1 通蔚ELISA试剂盒

  实验前准备

  阅读说明书。在进行ELISA实验前，要充分了解ELISA说明书，了解实验原理、操作步骤及注意事项！

  准备实验材料。通过阅读说明书，准备接下来ELISA实验所需的器材及试剂。比如常见有酶标板、抗体（一抗和二抗）、酶标抗体和底物、封闭液、终止液和酶标仪等。

  复温试剂。在实验之前，需要将试剂进行复温操作，可以保证试剂的稳定性和实验结果的准确性，在开始实验之前，应将试剂盒从冰箱中取出，室温放置15-30分钟，使试剂恢复至室温。

  配置洗涤液。洗涤液在ELISA实验中起到去除未结合的物质，减少背景干扰的重要作用。一般有2种方式：

  方式一：使用浓缩洗涤液。大多数ELISA试剂盒会提供浓缩洗涤液。你需要按照说明书上的比例，用蒸馏水或去离子水稀释浓缩液。

  方式二：使用洗涤液粉剂。一些ELISA试剂盒会提供洗涤液粉剂。你需要按照说明书上的指示，将粉剂溶解于一定量的蒸馏水或去离子水中，并充分搅拌至完全溶解。

  不管采用上述哪种方式，其都要遵循说明书进行配置，并严格按照说明进行操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。

  准备酶标仪：打开酶标仪预热，设置检测波长。

图2 酶标仪

  实验步骤

  ELISA实验步骤通常有包被、洗涤、封闭、洗涤、加样、洗涤、加酶标抗体、洗涤、显色、终止反应和测定吸光度值。接下来以小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA试剂盒步骤说明使用方法。

  实验原理

  试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。elisa实验原理，可以参考《一文读懂酶联免疫吸附实验（ELISA）原理及步骤》

图3 ELISA试剂盒原理

  试剂准备

  小鼠脂肪酸合成酶抑制剂（FASI）试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

  20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

  操作步骤：

  1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

  2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

  3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

  4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

  5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

  6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

  7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

  实验结果计算

  以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

  注意事项

  1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

  2.洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

  3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

  4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

  5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

  6.在储存和温育时避免强光直接照射。

  7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

  8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

  9.不能使用过期产品。

  10.如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

  上述为大家介绍了ELISA试剂盒使用方法，文中采用是小鼠1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA试剂盒，不同的试剂盒操作步骤有所差异，大家可以根据自己试剂盒说明书进行对照操作。ELISA 试剂盒为科研和临床诊断提供了方便快捷的检测工具。通过正确使用 ELISA 试剂盒，可以获得准确可靠的实验结果。