选择抗体和考虑浓度的要点

  在计划使用抗体的实验时，必须选择并确定要使用的抗体类型及其浓度等条件。另外，如有必要，请考虑使用二抗。那么，我们在选择抗体和确定条件时具体应该关注哪些点呢？

  本文总结了选择和使用一抗时需要考虑的要点、如何调整浓度以及使用时如何选择二抗。如果详细了解一抗和二抗可以参考《科研实验必备知识：一抗与二抗的区别》

  选择和使用抗体时应考虑的事项

  确定目标分子（抗原）并选择检测方法后，选择检测目标的一抗。如果针对目标分子有不止一种抗体可用，则使用多种抗体进行主要实验可能会更好。选择抗体时请考虑以下几点。

  一、用于研究的应用

•   并非所有抗体都适用于每种应用。
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•   确定您想要进行的测定是定性的还是定量的。
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•   检查供应商的数据表或网站，了解抗体是否适合您的特定应用，例如免疫印迹或 ELISA。

  二、待测样品类型

•   感兴趣的组织或细胞是否表达特定的蛋白质？
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•   您想要检测的蛋白质是潜在的还是活跃的？例如，磷酸化特异性抗体可能仅与活化的磷酸化蛋白质反应。
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•   如果感兴趣的蛋白质位于细胞内，则可能需要裂解部分或全部细胞。
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•   流式细胞术分析可能需要使用识别细胞表面分子的抗体。
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•   如果感兴趣的蛋白质具有 3D 结构并且表位不清楚，则其天然状态下的抗体将无法识别，并且样品必须变性。
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•   有些抗体仅在冷冻标本或未固定的组织中发挥良好作用。其他抗体在抗原修复步骤后对石蜡包埋切片起作用。

  三、待检测蛋白质的来源物种

•   选择抗体时，您通常选择一种针对从感兴趣物种获得的免疫原而产生的抗体。
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•   如果用于产生抗体的免疫原不是来自感兴趣的物种，请检查它是否与感兴趣的样品发生反应。您可以在蛋白质数据库 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中快速检查特定蛋白质的序列。

  四、用于抗体生产的物种

  该信息在选择二抗时非常有用。二抗在系统发育上应尽可能远离样本来源的物种。

  五、检查数据表和验证数据

•   检查供应商网站上的数据表和验证数据并考虑数据的质量。
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•   检查是否仅测试了抗原的存在或不存在（ELISA、蛋白质印迹）或是否有其他详细数据。
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•   了解正在测试的样品类型（细胞裂解物、组织匀浆等）。如果仅使用纯化的重组蛋白，则实际的细胞或组织样品可能无法获得最佳结果。

  六、技术服务和支持

•   检查卖家是否有任何保证，例如退款或积分。
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•   了解可以获得哪些类型的技术支持。拥有实际的技术支持比网站上的常见问题解答 (FAQ) 更好。

  如何调节抗体滴度和浓度

  抗体-抗原结合的强度取决于结合常数，其在温度、pH、溶剂成分等的影响下发生变化。抗原-抗体复合物的形成也可以通过改变溶液中抗体和抗原的相对浓度来控制。

  抗体浓度和滴度不是同义词。浓度是溶液中所含抗体的总量。通常，活性、功能性抗体总量中只有一小部分具有结合抗原的能力。但这个功能部分决定了它的有效性。效价是指在免疫测定中使用抗体时发生反应的最大稀释度。换句话说，它表示即使抗体-血清溶液被稀释，仍然观察到可检测量的抗体的程度。

  在大多数情况下，无法调整样品中抗原的浓度。因此，必须针对每个特定的实验条件凭经验确定抗体的最佳工作浓度（稀释度）。

  对于任何测定，最佳滴度是产生最强的阳性测试响应和最小的背景响应的浓度（稀释度）。必须为每次测定确定最佳抗体浓度。通常使用稀释系列进行判断。

  确定最佳抗体浓度的最佳方法如下。首先，选择固定的孵育时间并制备和测试一系列稀释液。稀释因子通常表示为较浓缩的储备溶液与所需溶液总量的比率。例如，将 1 份抗体储备液与 9 份稀释液混合，总共 10 份，制备 1:10 的抗体稀释液。

  数据表或方案还可能推荐与抗体一起使用的适当稀释度。然而，当首次使用抗体或使用新批次时，建议使用稀释系列来确定所用抗体的最佳稀释度。

  例如，如果产品数据表建议使用 1:500 稀释度，则可以针对特定的检测条件使用 1:50、1:100、1:500、1:1,000 和 1:10,000 的稀释度。帮助确定最佳稀释率。

  特别是对于多克隆抗血清，不同动物或一种血清样品与另一种血清样品之间的抗体浓度可能存在显着差异。因此，这种早期滴定对于减少测定间变异至关重要。

  什么是二抗？

  二抗通常用于间接检测一抗所结合的抗原。因此，选择对一抗的物种或同种型具有特异性并与可检测标签或标记偶联的二抗非常重要。

  

二抗原理

  可检测的标签包括酶和荧光染料。常用的标签有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白（PE）和生物素。

  当没有可用的标记一抗或一抗未用所需酶或荧光染料标记时，使用二抗。

  二抗也用于提高检测灵敏度。尽管使用二抗需要额外的步骤，但优点是多个二抗与单个一抗结合，从而放大信号并提高灵敏度。

  正确选择二抗可改善染色效果并最大限度地减少假阳性或阴性。

  二抗是通过使用不同物种的抗体对宿主动物进行免疫来产生的。例如，抗山羊抗体是通过将山羊抗体注射到山羊以外的动物体内来产生的。同样，如果一抗是在小鼠中产生的，那么二抗必须是在另一个物种（山羊、驴等）中产生的抗小鼠抗体。

  大多数一抗属于 IgG 类。这些抗体可以通过适当的抗 IgG 二抗来检测。如果一抗是 IgM，则必须选择 IgM 特异性二抗。

  如何选择合适的二抗

  二抗必须针对产生一抗的同一物种。例如，如果一抗是在山羊中产生的，则二抗必须是抗山羊抗体。

  根据您的专业知识和实验室可用的设备选择所需的荧光染料或酶联抗体。最常用的荧光染料标记包括荧光素、罗丹明、德克萨斯红和藻红蛋白。酶标记包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

  酶联抗体是 ELISA 检测的良好选择。荧光染料偶联的二抗最适合用于流式细胞术。

  生物素标记的抗体比用荧光染料或酶标记的二抗更敏感，并提供放大的信号。

  为了获得更好的结果，请使用预吸附有与样品相同物种的血清的二抗。这减少了背景。然而，此类预吸附抗体识别表位的能力降低，可能无法识别某些 IgG 亚类。

  二抗有两种：用蛋白 A 等纯化血清而得到的“IgG 级分二抗”和仅纯化以下抗体而得到的“亲和纯化二抗”。通过亲和纯化与目标分子发生反应。亲和纯化二抗的优点是非特异性结合最小化。然而，如果它含有高亲和力的抗体，则很难从柱上洗脱，因此 IgG 级分可能是优选的。如果抗原的含量非常低，则 IgG 组分可能更合适。

  选择与一抗类别或亚类相匹配的二抗。例如，如果一抗是小鼠 IgM，则使用抗小鼠 IgM 二抗。如果小鼠单克隆一抗的类别或亚类未知，可以使用识别大多数小鼠 IgG 亚型的抗小鼠 IgG。

  以上，我们讲解了一抗的选择和使用要点，如何调整浓度，以及如何选择二抗。记住这些要点并创建适合您的目的和目标的实验计划。