elisa实验结果不准确？掌握这3大因素让实验结果更可靠！

  酶联免疫吸附试剂盒，英文缩写elisakit，中文也叫ELISA试剂盒或ELISA检测试剂盒。是酶联免疫分析中常用的方法。ELISA基本原理是抗原（或抗体）与固相载体表面结合并保持其免疫活性。抗原（或抗体）与酶连接成为酶标抗原（或抗体），酶标抗原（或抗体）既保留了其免疫活性又保留了其酶活性。

  ELISA实验中，待测标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）在不同的步骤中与固相载体表面的抗原或抗体发生反应。将在固相载体上形成的抗原抗体复合物通过洗涤的方法与其他物质分离，最后与固相载体结合的酶的量与标本中待检测的抗体或抗原的量成正比。然后加入酶反应底物，底物在酶的催化下变成有色产物，根据显色反应的深度进行定性或定量分析，了解待测样品中抗体或抗原的含量。

  

  ELISA在科研中应用比较广泛。但ELISA实验操作也一定的技术要求，通常在ELISA实验中会遇到一些问题，比如错误结果（既假阳性或阴性的结果）。这些错误结果往往会影响科研进展。了解影响ELISA结果因素非常有必要，下面通蔚生物为大家总结错误结果常见的三大因素：

  1、样本因素

  2、试剂因素

  3、操作因素

  一、样本因素

  可用于ELISA检测的标本广泛：体液（如血清、血浆、脑脊液）、分泌物（唾液）、排泄物（如尿液、粪便）均可作为标本测定抗体或抗原成分。有些标本可以直接测量（如血清、尿液），而另一些则需要预处理（如粪便和某些分泌物）。

  血清是ELISA检测中最常用的样本。血浆通常被视为与血清相同的样本。标本引起的假阳性、假阴性结果主要是由干扰物质引起的，干扰物质分为内源性物质和外源性物质：

  内源性物质

  有研究提示，约40%的人血清样本中含有非特异性干扰物质，会不同程度地影响检测结果。

  常见干扰物质：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗小鼠Ig(s)抗体、交叉反应物质等。

  1、类风湿因子

  人血清中的IgM和IgG型类风湿因子（RF）可以直接与ELISA系统中的FC片段结合，FC片段可以捕获抗体和酶标二抗导致假阳性。

  2、补体

  在ELISA系统中固体一抗和标记二抗的过程中，抗体分子发生变构。C1q分子，是抗体分子FC片段的互补体，其结合位点是暴露的。C1q可以将两者结合起来，导致误报。

  3、异嗜性抗体

  人血清含有与啮齿类动物（例如鼠类等）Ig结合的天然异嗜性抗体，可以在ELISA系统中连接一抗和二抗，也可能导致假阳性。

  4、针对目标抗原的自身抗体

  靶抗原的自身抗体，例如抗甲状腺球蛋白和抗胰岛素，有时会与靶抗原结合形成复合物，从而干扰ELISA方法中的抗原抗体测定结果。

  5、医源性诱导的抗小鼠Ig(s)抗体

  鼠源CD3等单克隆抗体的临床应用、放射性同位素标记的鼠源抗体影像诊断、靶向治疗等新技术可能会导致这些患者体内产生抗鼠抗体。此外，被大鼠等啮齿类动物咬伤的患者体内也可产生抗小鼠Ig(s)抗体。这些患者在进行ELISA检测时可能会产生假阳性。

  6、交叉反应物质

  地高辛类、AFP类物质等可与靶抗原发生交叉反应。当用多克隆抗体测定抗原时，测定结果不会受到太大影响。然而，当用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇恰好是所用单克隆抗体对应的目标决定簇，则可能会出现假阳性结果。

  7、其他物质

  血脂、胆红素、血红蛋白过高、血液粘度过高等都会对ELISA结果产生干扰作用。

  外源性物质

  外源性物质的影响常常是由于用于ELISA测定的血样采集和保存不当造成的。如标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长、标本凝集不完全、采血管内添加物的影响等。

  1、标本溶血

  各种人为因素引起的标本溶血，红细胞被破坏时，可释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白。在辣根过氧化物酶标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，从而干扰测定结果。为了克服上述干扰效应，采集标本时必须避免溶血。

  2、标本被细菌污染

  由于细菌可能含有内源性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本与溶血标本一样，也会产生非特异性显色，干扰测量结果。

  3、标本保存不当

  冰箱保存时间较长的标本，血清中的IgG可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，导致ELISA背景过高，甚至间接ELISA出现假阳性。标本放置时间过长（超过1天），有时抗原或抗体的免疫反应性减弱，可能出现假阴性。

  为了克服上述干扰，ELISA测定的血清样品应新鲜采集。如不立即测定，5天内测定的血清样本可在2-8℃保存，-20℃不超过1个月，-80℃不超过2个月。标本冻存后溶解，蛋白质部分浓缩且分布不均匀。测定前应将蛋白质充分混合。但混合时应轻柔，不宜剧烈振荡。

  4、标本凝集不完全

  在没有促凝剂和抗凝剂的情况下，正常血液在采集后0.5至2小时开始凝固，并在18至24小时完全凝固。如果在血液未完全凝固时离心血清，部分纤维蛋白原残留在血清中，ELISA测定时会形成肉眼可见的纤维蛋白块，容易造成假阳性结果。因此，血样采集后，必须充分凝固后分离血清，或者用采血管采集标本，并在采血管中加入分离胶或合适的凝固剂。

  5、样品管内添加物质的影响

  抗凝剂（如肝素）、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性）、快速血清分离胶等均可干扰ELISA测定。

  综合上述，如果大家在ELISA实验过程出现假阳性或者假阴性结果，大家可以先从标本因素来去分析，采取相应的措施消除干扰，从而获得正确、可靠的结果。

  试剂因素

  目前，市场上的elisa试剂盒良莠不齐，质量不高的试剂盒质量将会对影响elisa检测的准确性。因此，选择合适的试剂盒是非常重要的！

  ELISA试剂盒的用途，如检测范围、检测样本、应用种类等；试剂盒的质量控制，例如特异性、敏感性和重现性；客户对试剂盒套件的验证，例如文献参考，以及套件的有效期，是我们需要考虑的主要因素。

  1、检测范围

  试剂盒的检测范围为标准曲线的范围。特别注意待测样品的浓度是否落在标准曲线范围内。对于浓度较高的样品，可以先进行初步实验，找到良好的稀释倍数，然后进行大量测量。在此之前，我们可以将ELISA试剂盒中给出的样本值与NCBI文献中给出的蛋白表达参考值uniprot或pax-dab进行比较。

  2、应用种类

  一般来说，不同物种的ELISA试剂盒不通用，除非试剂盒中有特别说明。

  3、测试样品

  对于ELISA试剂盒，常见的待测样品类型有：血清和血浆（不同的抗凝剂）、细胞上清液和细胞裂解物。ELISA试剂盒说明书中详细说明了待测样品的类型和稀释液，请注意不同样品的稀释液不要混合。

  4、特异性

  ELISA试剂盒的特异性与试剂盒的关键成分——抗体（对）有关。该试剂盒用于筛选靶向抗体材料，经过严格控制，保证了试剂盒的特异性。

  5、灵敏度

  ELISA灵敏度反映了试剂盒检测最小量待测物质的能力。您可以根据样品中待测指标的多少来选择合适的试剂盒。如果待测指标量很低，一般试剂盒无法满足要求，可以选择高灵敏度ELISA试剂盒。

  6、重复性

  科学实验注重可重复性。对于一般ELISA试剂盒，板内和板间变异系数应控制在15%以内。在CUSABIOELISA试剂盒中，大多数板内变异系数小于8%，板间变异系数小于10%。

  7、文献引用

  产品文献引用，尤其是高质量SCI文章的引用，是很多客户关心的问题。这是产品识别的一个非常重要的指标，对于相关用户的研究具有一定的参考作用。CUSABIOELISA试剂盒的客户参考文献已达4500余篇，并且每年以数百种的速度增长。

  8、有效期

  一般情况下，试剂盒的有效期为半年，在制备样品时需要考虑试剂盒的有效期。

  操作因素

  ELISA技术具有较高的灵敏度和特异性，在生物学研究中得到广泛认可，在临床检测中也得到广泛应用。对于初学者来说，如果在实验操作过程中不注意ELISA的所有步骤，可能会对最终的实验结果产生比较大的影响，如板白、显色弱、灵敏度低、花板现象、无梯度和高ELISA背景。

  综上所述，在ELISA实验中应严格遵循ELISA操作规程，并注意以下问题：

  A.试剂保存：蛋白抗体试剂短期不用时可保存在-20℃，显色底物溶液的洗涤液保存在2-8℃。

  b.终止反应时尽量避免微孔中出现气泡。

  C.酶标仪读数应在反应终止后5分钟内完成。

  提前准备试剂

  A.预涂酶标板和各试剂组分需要在室温下平衡30分钟以上。

  b.试剂使用前应充分混匀，以保证试剂的均匀性和准确性。

  C.普通洗涤液是浓缩液，需要提前稀释，pH值应保持在7.2～7.4之间。

  d.一般检测抗体和酶标二抗需要用相应的稀释度稀释至工作浓度。

  e.不同批次的试剂不能混合，并应检查各组分的有效性。

  添加测试样本

  A.如果检测样品过多，建议分批操作。

  b.需要稀释的样品应提前稀释。请参阅使用说明书选择合适的稀释剂。

  C.控制上样时间，避免上样时间过长造成误差。

  d.注意加样角度。垂直添加到板底部，不要接触ELISA板壁。

  e.一份样品，一个移液器吸头。防止交叉污染。

  孵育和洗涤

  A.孵育时间和温度按照试剂盒中的说明进行。

  b.在水浴或湿盒中孵育以避免“边缘效应”。

  C.注意洗涤次数、洗涤液的用量、洗涤液浸泡的时间长短、洗涤的强度。

  d.手洗ELISA板时，请将板垂直，避免交叉污染；力不能太强以防止抗原-抗体复合物脱离。

  e.用洗板机洗板时，要经常检查冲洗头是否畅通。

  显色

  显色反应需要避光，在37℃或室温下反应15至30分钟。

  读取与数据分析

  终止反应时尽量避免微孔中出现气泡。

  酶标仪读数应在反应终止后5分钟内完成。

  酶标仪应提前预热15至30分钟。

  数据分析一般采用四参数、直线拟合法进行；标准曲线的相关系数（R2）可用于确定选择哪种拟合方法。R2一般需要大于0.99，可以点击这里查看ELISA数据分析方法。

  试剂保存

  A.短期不用的蛋白质和抗体试剂保存在-20℃。

  b.显色液和洗涤液储存于2-8℃。

  上述为大家介绍影响酶联免疫试剂盒的结果的因素，当ELISA结果不理想的时候，综合上述3种因素考虑，从而提高实验的准确性。如果您还有疑问，可以和我们在线ELISA顾问寻求帮助！如果考虑ELISA试剂盒，上海通蔚实业有限公司拥有15年以上的ELISA试剂盒生产经验，搭建了ELISA试剂盒开发和成熟抗原-抗体系统的良好平台。可提供4000多种ELISA试剂盒，主要采用夹心法和竞争法，覆盖3000个靶标，涉及小鼠、大鼠、牛、兔、猪等20多个种类。