ELISA 与蛋白质印迹：两种常见免疫测定法的比较

  在生物医学研究中，"免疫测定"一词是常用术语。对于实验室工作人员来说，免疫测定有不同类型是常识。

  什么是免疫测定？

  免疫测定是一种借助抗体-抗原相互作用或反应来评估给定溶液中大分子的存在和浓度的技术。

  在我们之前的一些文章中，我们重点介绍了两种免疫测定法——ELISA 和蛋白质印迹——广泛用作蛋白质浓度分析的生物分析方法。鉴于两者具有相似的目的，即使对于最熟练的实验室专家来说，两者之间的选择也是一个挑战。蛋白质印迹法和 Elisa 法哪个更好？– 迄今为止，对于大多数科研人员来说，这是一个重要的困境。

  在本文中，上海通蔚通过强调这两种生化技术的差异并比较它们在实验室应用中的可用性和适用性，让您深入了解这两种生化技术。我们希望这些信息能够消除您的疑虑并回答您有关该主题的所有问题。

  什么是酶联免疫吸附测定？

  酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是一种经济有效的分析工具，通常用于分析抗体、抗原、蛋白质和糖蛋白。ELISA 是免疫测定的黄金标准，灵敏度高，是一种测量尿液、血清或细胞培养物等各种样品中蛋白质存在情况的简单方法。Elisas 还有助于广泛应用的细胞因子分析，包括神经系统疾病的分析。

图1 elisa

  目前，elisa方法分为4种类型，分别包括：

  1、直接elisa

  2、间接elisa

  3、夹心elisa

  4、竞争elisa

  在 ELISA 方法中，样品中的抗原附着在聚苯乙烯板上。使用与酶结合的相同抗体来使抗原与其结合。洗涤后，从板上除去所有未结合的抗体，并在洗涤后应用酶底物。当发生结合时，这种酶底物会产生可见信号，例如颜色变化。

  Elisa优缺点

  一、Elisa优点：

  1、Elisa 方法最适合检测极少量、稀有或低丰度的目标蛋白。

  2、Elisa 免疫分析高度灵敏，可以测量样品中目标蛋白的精确含量。

  3、该技术对于测定蛋白质浓度或监测一段时间内蛋白质水平的变化非常有用。

  4、ELISA 可以非常快速地提供高通量，易于执行，并且几乎不需要为各种应用准备样品。因此，对于时间紧迫的实验室专家来说，这种方法是日常或定期进行检测的便捷选择。

  5、Elisa 检测具有成本效益。

  二、Elisa缺点：

  1、传统上，一种 Elisa 检测只能靶向一种蛋白质，因此不可能进行多重检测。因此，同时分析单个样品中的多种蛋白质变得很困难。

  2、ELISA 检测的灵敏度范围有限。

  3、除了目标分子之外，Elisa 测定中使用的抗体还可以结合相似或结构相关的分子。这可能导致假阳性或假阴性结果，并影响测定的准确性、可靠性和特异性。

  4、Elisa 检测有时会干扰样品基质，从而导致灵敏度或特异性降低。

  5、ELISA 检测缺乏标准化可能是一个限制。

  什么是蛋白质印迹技术？

  蛋白质印迹程序是广泛用于蛋白质分析的最典型的细胞和分子生物学程序之一。蛋白质印迹法也称为蛋白质免疫印迹法，有助于确定给定样品中特定蛋白质的存在、大小和数量。蛋白质印迹步骤包括：

图2 蛋白质印迹

  1）按尺寸分离，

  2) 转移到固体支持物或膜上，并且

  3) 使用适当的一抗和二抗标记目标蛋白以进行可视化。

  蛋白质印迹原理

  蛋白质印迹分析依赖于聚丙烯凝胶电泳和抗体的使用。该技术允许研究人员使用电泳（充当分子筛）根据蛋白质的分子量和类型从凝胶状样品中分离和识别蛋白质。

   然后分离的蛋白质被转运到膜上，其中每个蛋白质形成一条带。然后用标记的抗体处理膜，这些抗体针对所需的蛋白质以产生彩色条带。可以鉴定这些抗体，并且可以根据已建立的标准或对照来分析结合蛋白的大小和丰度。

  蛋白质印迹优缺点

  一、蛋白质印迹优点：

  1、使用蛋白质印迹技术，可以从具有相似特性或尺寸的细胞中提取的复杂蛋白质混合物中分离出单个蛋白质。

  2、蛋白质印迹非常适合分析复杂的混合物，例如细胞裂解物，并且可以检测目标蛋白水平较低的样品中的特定目标蛋白。

  3、该技术可以利用蛋白质大小、丰度、分子量等因素以及了解蛋白质表达模式、研究蛋白质修饰以及研究蛋白质-蛋白质相互作用和杂质所必需的信息来确认蛋白质。

  4、蛋白质印迹可用于蛋白质表达水平的定量分析。

  5、蛋白质印迹具有多种用途，因为它可以使用多种样品类型，包括细胞裂解物、组织、血液和其他生物液体。

  6、蛋白质印迹法通常用作验证技术来验证从其他测定（例如 ELISA 或质谱法）获得的结果。

  二、蛋白质印迹缺点：

  1、蛋白质印迹可以提供相对蛋白质丰度的估计，这使其成为一种半定量技术而不是绝对定量方法。

  2、蛋白质大小的分辨率可能受到限制，特别是对于具有相似分子量的蛋白质。

  3、蛋白质印迹对样品的变异性和复杂性很敏感。

  4、与 Elisa 检测一样，蛋白质印迹中使用的抗体可能会表现出交叉反应性，与非预期的蛋白质结合或产生非特异性信号，导致假阳性或假阴性结果并影响数据解释。

  5、蛋白质印迹可能并不总能提供蛋白质修饰的全面分析。

  6、蛋白质印迹涉及凝胶电泳、蛋白转移、封闭、抗体孵育和信号检测等多个步骤，耗时、费力且成本高昂。

  7、蛋白质印迹结果的解释可能是主观的，特别是在比较相对线强度时，并且需要经过训练的眼睛。

  ELISA 与蛋白质印迹对比

  现在我们知道了这两种技术的优点和局限性，我们比较下表中的主要差异。

特征	elisa	蛋白质印迹
原理	酶标记免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）	蛋白质分离和免疫检测
检测对象	液态样品（例如血清、细胞培养上清）	细胞提取物、组织提取物
灵敏度	通常具有较高的灵敏度，可检测低至pg/mL水平的蛋白质	可以非常灵敏地检测特定蛋白质
多样性	可以用于检测多种蛋白质，需要有对应的抗体	可以检测多个蛋白质，但需要进行多轮实验
自动化程度	可以进行高通量分析，并且有许多商业化的自动化系统可供选择	较难进行高通量分析，通常需要手工操作
耗时	可以在几小时内完成整个实验	实验时间较长，通常需要一天或更长时间
成本	相对较低，ELISA试剂盒的成本较低	仪器和试剂成本较高

  据观察，这两种技术都可以检测和定量蛋白质，各有优缺点。我们希望这些信息可以帮助您就最适合您的实验室实验或应用的方法做出更明智的决定。