PCR 技术新篇章：染料法 PCR 详解

  上篇文章介绍了探针法PCR及它的工作原理，这篇文章，我们来认识下PCR技术—染料法PCR。这听起来有点像探针法PCR兄弟，它们都属于qPCR。现在，我们一起来了解下染料法PCR。探针法 PCR可以参考这篇文章《探针法PCR工作原理详解：从荧光到基因定量》

  什么是染料法PCR？

  染料法PCR是一种经济高效的qPCR，可基于DNA结合染料的荧光检测来测量PCR（聚合酶链式反应）过程中的双链DNA扩增。除了qPCR混合物、无核酸酶水和DNA之外，它只需要两个序列特异性引物，这使其成为观察大量目标时经济高效的选择。

  染料法PCR是如何工作的？

  如前所述，染料法PCR使用DNA结合荧光染料。在与DNA结合之前，染料呈现低背景荧光。在扩增过程中，染料会与样品中发现的任何双链DNA产物结合。这导致荧光的增加与每个循环中存在的PCR扩增子的增加成正比。

  每个PCR循环后测量荧光。当足够的荧光染料与双链DNA结合并具有比背景荧光更高的荧光时，就达到阈值循环(Ct)，也称为定量循环(Cq)。Ct值用于定量样品中目标DNA的量（Ct水平越低，样品中目标DNA的量越大）。

图1 荧光染料为 SYBR GreenⅠ染料

  染料法PCR被认为具有成本效益，因为每个目标只需要两个序列特异性引物，但由于这些引物是确定反应特异性的唯一方法，因此它的特异性不如传统PCR或探针法PCR。然而，它比购买探针法PCR的引物和探针要便宜得多。

  染料法PCR中引物的主要问题是它们往往会形成引物二聚体或非特异性扩增子。遗憾的是，该染料将检测并结合任何双链DNA，其中还包括所有脱靶，即非特异性扩增产物。这可能导致目标序列的定量不准确。

  然而，有一种简单的方法可以识别问题。可以使用熔解曲线来比较扩增产物的熔解温度。这可以验证扩增的特异性并检查非特异性扩增产物的存在。

  熔解曲线分析基于以下事实：不同的双链DNA链根据各种因素（GC含量、SNP等）在不同温度下彼此解离。当PCR产物被加热并且双链开始解离时，就会产生熔解曲线，在此期间荧光染料也从链上解离，因此可以检测到荧光下降。

  qPCR机器完成数据收集后，您将获得扩增图，直观地显示qPCR期间DNA的积累情况。这些线条显示了染料的荧光信号，该信号标准化为被动参考染料（例如ROX）的信号减去qPCR机器生成的基线。它应该看起来像这样：

图2 SolisFAST® SolisGreen® qPCR 混合物的扩增图

  染料法PCR的优点和缺点

  染料法PCR如此受科学家欢迎的原因有很多。这里是其中的一些：

  1、成本（仅2个引物）——比探针法PCR更经济的选择。

  2、比探针法PCR更容易设计。同样，前者只需要2个引物。后者需要2个引物和一个非常特殊放置的探针。

  3、与探针法PCR不同，除了目标的基因之外，还可以检测错误。这样，下次就可以优化实验并获得更好的结果。

  遗憾是，与所有方法一样，染料法PCR并不适合所有实验设计。以下是一些缺点：

  1、不可能进行多路复用。

  2、其特异性较低。

  染料法PCR有哪些染料可供选择？

  染料法PCR最重要的部分当然是染料。一些建议，帮助您为qPCR实验选择合适的染料。

  经典且可能最常用的染料是SYBR®Green。然而，还有更好的选择，可能还没有那么流行，但值得考虑。其中之一是EvaGreen®，它在光谱上与SYBR®Green相似，因此使用时无需更改任何光学设置。EvaGreen®在室温和PCR条件下都非常稳定。它对浓度的抑制较小——可以增加染料的浓度以增加荧光，而不会扰乱反应。这还可以实现更好的高分辨率熔体分析。此外，由于其新颖的“按需释放”DNA结合机制，EvaGreen®染料的背景比SYBR®GreenI更少。最重要的是，EvaGreen®还被认为比SYBR®Green毒性更低、对环境更安全。

  另一种选择是SolisGreen®，它也与其他常用的qPCR染料共享光谱特性。基于SolisGreen®染料的qPCR混合物具有高灵敏度和更高的性能（更亮的荧光），目标浓度低，显示出更高的精度和技术重复之间的差异更小。

  当然还有多种其他染料可供选择，但所有SolisBioDyne产品均基于EvaGreen®或SolisGreen®，以确保良好的产品稳定性、效率和可持续性。

  上述是染料法PCR介绍，通过上文你对染料法PCR有所了解。染料法PCR和探针法PCR有所差异，可以对比实验来去了解之间的差异。具体选择染料法和探针法要结合当前的实验。如果您对染料法还有什么疑问，可以咨询我们在线技术寻求帮助。如果您想了解染料法试剂盒，欢迎前来咨询。