【通蔚生物】：NADH氧化酶(NOX)测试盒

通蔚生物NADH氧化酶(NOX)测试盒样本的前处理

注 意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将 NADH 氧化
为 NAD。该酶不仅参与 NAD 的再生，而且与免疫反应密切相关。
测定原理：
NOX 能够将 NADH 氧化为 NAD，NADH 的氧化与 2,6 二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的 DCPIP
被还原为无色的 DCPIP，在 600nm 下测定蓝色 DCPIP 的还原速率计算出 NADH 氧化酶活性的大小。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水
试剂的组成和配制：
试剂一：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存。
试剂二：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存。
试剂三：液体 1mL×1 瓶，-20℃保存。
试剂四：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂五：液体 6 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复
冻融。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 NOX（此步可选做）。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或
200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于 NOX 活性测定。
血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 600nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）试剂四、试剂五和试剂六于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。
（2）在 1mL 石英比色皿中加入 40μL 样本、700μL 试剂四、100μL 试剂五和 160μL 试剂六，混匀，记
录 600nm 处 20s 时吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
NOX 活力单位的计算
1、血清（浆）NOX 活力的计算:
单位的定义：每 mL 血清（浆）在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mL）＝ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T=2500×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NOX 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。
NOX（U/10⁴cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V 反总：反应体系总体积，1mL； V 样：加入样本体积，0.04mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；

T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500 万。

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