【通蔚生物】：NAD-苹果酸酶(NAD-ME)测试盒样本处理

通蔚生物NAD-苹果酸酶(NAD-ME)测试盒样本处理

测定意义：
ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，
产生丙酮酸和CO2，以及伴随NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来
植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为
NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理：
NAD-ME催化NAD+还原成NADH，在340nm下测定NADH增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。
样本的前处理：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：

1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔

10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、将试剂一、二、三和四置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。如果一次性测定样本较多，可将试
剂一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上（现配现用）。
注意：如果ΔA＜0.005，可将反应时间延长到2分钟或5分钟。
NAD-ME活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=4823×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=4823×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=9.646×ΔA
V反总：反应体系总体积，9×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本
体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；
500：细菌或细胞总数，500万。
注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
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