【通蔚生物】：酸性蛋白酶(ACP)测试盒测定意义

通蔚生物酸性蛋白酶(ACP)测试盒测定意义如下：

ACP 是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、
酱油酿造、饲料等。
测定原理：
酸性条件下，ACP 催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝
在 680nm 有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算 ACP 活性。
自备仪器和样品：
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿、1.5 mL EP 管和蒸馏水。
试剂组成和配置：
液体一：1.5mL×1 支，4℃保存。
液体二：1mL×1 支，4℃保存。
试剂一的配制：临用前按液体一：液体二：蒸馏水=76（μL）：17（μL）：18（mL）的比例配制，现配现
用，如出现白色絮状沉淀则不能用。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 10 mL 蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 20 mL 试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一
层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出
现颗粒物不溶物不影响使用）。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 50 mL 蒸馏水溶解。
试剂五：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
标准品：液体 1mL×1 支，0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 试剂一的配制：见试剂的组成和配制。
2. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试
剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。
3. 血清或培养液：直接测定。
4. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞
加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后
8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：
1.分光光度计预热 30min，调节波长到 680 nm，蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于 30℃水浴保温 30min。
3. 对照管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液，200μL 试剂二，混匀后置于 30℃水浴保温 10min；加入 200μL
试剂三，混匀后 8000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 试剂四，200μL
试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 对照管。
4. 测定管：取一支 EP 管，加入 100μL 粗酶液，200μL 试剂三，混匀后置于 30℃水浴保温 10min；加入 200μL
试剂二，混匀后 8000g， 4℃离心 10min；取 200μL 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μL 试剂四，200μL
试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 测定管。（注意与空白管不同，
先加试剂三，后加试剂二）
5. 空白管：取 EP 管，加入 200μL 蒸馏水，1000μL 试剂四，200μL 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温
20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 空白管。
6. 标准管：取 EP 管，加入 200μL 标准品，1000μL 试剂四，200μL 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温
20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 标准管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
ACP 活性计算公式：
1. 按照样本蛋白浓度计算
ACP 活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
ACP 活性（nmol/min /mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总
÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr
2．按照样本质量计算
ACP 活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
ACP 活性（nmol/min /g 鲜重）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷
（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W
3. 按照液体体积计算
ACP 活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
ACP 活性（nmol/min/mL）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷V1÷T=
125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）
1. 按照细胞数量计算
ACP 活性单位定义：30℃每 104个细胞每分钟催化水解产生 1nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。
ACP 活性（nmol/min /104 cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷
（细胞数量×V1÷V2）÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量
C 标准品：0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液；V 反总：酶促反应总体积，0.5mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度
（mg/mL）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），0.1 mL；V2：提取液总体积（mL），1mL；T：催化
反应时间（min），10min；W：样品质量（g）。
注意事项：
1.试剂一按操作指示配制，用多少配多少，出现白色絮状沉淀则不能用。
2.临用前配制的试剂配置好后 3 天内使用完毕。
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