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技术服务

试剂盒实验操作视频

试剂盒实验视频操作


  实验步骤：


  1. 样品准备

  裂解液（RIPA）准备-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原钒酸钠溶液，现配现用。加入PMSF，加入原钒酸钠溶液。

  组织样本-----黄豆大小组织剪碎，加入200-300 ul配备好的裂解液，冰上研磨，12000转离心5 min，取上清。

  贴壁细胞-----6孔板一个孔长满，加150 ul配备好的裂解液，冰上裂解5-10 min，枪头吹打，吸取裂解好的样本，转入EP管，12000转离心5 min，取上清。

  悬浮细胞-----细胞转入离心管，2000转离心5 min，弃上清，加入PBS清洗，2000转离心5 min，弃上清，每20 ul体系细胞加入150 ul裂解液，冰上裂解5-10 min，枪头吹打充分裂解，12000转离心5 min，取上清。

  2. 蛋白浓度测定

  标准曲线制备

  待检样本上样

  加入显色剂，室温避光20-30 min

  酶标仪测定OD值

  计算蛋白上样量（建议每样本上样总蛋白含量为50 μg）

  3. 样本变性

  每40 μL蛋白，加10 ul的5XSDS 上样缓冲液

  沸水浴10 min

  -20℃保存

  4. SDS-PAGE胶制备

  灌入分离胶

  无水乙醇压平

  分离胶完全聚合后，倒出无水乙醇

  双蒸水冲洗

  滤纸吸干

  加入浓缩胶

  插上梳齿

  浓缩胶完全聚合后取出梳齿

  5. 电泳

  胶固定到电泳槽

  倒入电泳液

  加样，加marker,

  电泳----80 V恒压至溴酚蓝到浓缩胶与分离胶交界处，改110 V恒压至溴酚蓝到凝胶底部