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简介
磷酸化AKT蛋白(p-AKT)是一种信号转导蛋白，在各种类型的肿瘤中发挥着抑制细胞凋亡的核心作用，AKT是一组三个丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶的总称，在多个细胞过程中发挥关键作用，如葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移，三个不同的基因编码蛋白激酶B异构体的基因被称为AKT1、AKT2和AKT3，分别编码RAC α、β和γ丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，pAKT与预后不良以及化疗和放疗抗性有关。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物p-AKT，清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中p-AKT的浓度。
需要的其他材料
1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2. 移液器及枪头；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀释标准品和样品的试管。
样品保存
样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从320μmol/L标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至16μmol/L（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的16μmol/L浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将16μmol/L标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为: 16μmol/L、 8μmol/L、 4μmol/L、 2μmol/L、 1μmol/L、 0.5μmol/L、 0.25μmol/L，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0μmol/L)。
抗体工作液配置
使用前10分钟，将100×生物素化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。
酶结合物工作液配置
使用前10分钟，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。
备 注：如待测样本中p-AKT浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。
结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。
若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
示例数据
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。
|
标准品浓度(μmol/L) |
16 |
8 |
4 |
2 |
1 |
0.5 |
0.25 |
0 |
|
OD值 |
2.484 |
1.781 |
1.016 |
0.755 |
0.425 |
0.261 |
0.154 |
0.061 |
|
校正OD值 |
2.423 |
1.72 |
0.955 |
0.694 |
0.364 |
0.2 |
0.093 |
0 |
下图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果
重复性
板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.13μmol/L。
特异性
该试剂盒测定可识别重组小鼠p-AKT。
其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。
