产品及特点：
柑橘黄龙病菌亚洲种(CandidatusLiberobacterAsiaticus)是一种类菌体，柑橘感染黄龙病后，全年均可发生，一般以夏梢和秋梢发病最多，其次是春梢。新梢的症状是叶片表现黄化和黄绿相间的斑驳。在叶片凋落后，枝梢上新长出的叶片表现缺素状的花叶。病梢变短、生势衰弱，病叶黄厚、变小，且易脱落，形成枯枝。开花不适时，花开的多、落得多。果小而畸形，或红鼻果。后期，根部往往表现为小根腐烂。此菌可以侵染芸香科柑橘属和金橘属植物，引发症状。通过菟丝子，此菌可以侵染长春花。在自然界，芸香科蚝壳刺属和木苹果属植物可能受此菌侵染，九里香属植物常见着生大量传播柑橘黄龙病的柑橘木虱，但其体内未见病原菌。本公司开发柑橘黄龙病菌染料法荧光定量PCR试剂盒。
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据柑橘黄龙病菌亚洲种保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
规格及成分：
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编号
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成分
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规格
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试剂一
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2×qPCRMagicMix
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500μL(棕色管)
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试剂二
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荧光PCR专用模板稀释液
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1mL(黄盖)
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试剂三
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柑橘黄龙病菌亚洲种染料法PCR 引物混合液
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100μL(白盖)
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试剂四
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柑橘黄龙病菌亚洲种染料法PCR 阳性对照(1×10E8/μL)
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50μL(红盖)
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试剂五
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DNA病毒裂解液(试用装)
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15次(9mL)
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使用手册
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1份
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运输及保存：
低温运输、-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：
DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。
使用方法：
一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)：
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
4. 在7号管中加入5μL1×10E8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备：
8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout或其升级版柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNAout。
三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)：
10. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
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成分
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样品管 N+2个
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PCR阴性对照管
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PCR阳性对照管(2-7管)
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2×qPCR MagicMix(棕色管)
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10μL
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10μL
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各10μL
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柑橘黄龙病菌亚洲种PCR引物混合液(白盖)
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2μL
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2μL
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各2μL
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自备10×ROX(见注)
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2μL
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2μL
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各2μL
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N+2待测样品DNA模板
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6μL
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不加
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不加
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第7步所得PCR阳性对照稀释液(2-7号)
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不加
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不加
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各6μL2号样到2号管,3号样到3号管
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注: 仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。
12.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
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过程
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温度
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时间
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预变性
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92℃
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5分钟
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PCR反应30个循环
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94℃
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60秒
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50℃
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60秒
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72℃
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60秒
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13.数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500nm，最大发射光谱在530nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理：
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
五、特别提示：
本公司的所有产品，仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
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