什么是标记抗体？一文带您了解标记抗体及作用

  抗体标记，即在抗体上附加特定标签以帮助检测或分离/纯化蛋白质，是一项重要技术。标记抗体对于免疫印迹、ELISA、流式细胞术、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)等免疫检测法至关重要。标记抗体还用于从复杂的蛋白质混合物中分离和纯化单个蛋白质。与其他蛋白质一样，抗体可以用小分子、放射性同位素、酶蛋白和荧光染料标记。

  传统上，通常采用两种不同的化学方法将抗体与小分子共价标记：

  该标记物与一级胺反应，用于标记抗体分子中的赖氨酸残基

  抗体链内的二硫键被还原，然后与硫醇反应性标记物发生反应

  然而，已经开发出新的方法，包括将标签非共价添加到抗体的Fc部分，或将标签共价添加到抗体重链的N连接聚糖上。

  所用标记类型取决于下游应用。上海通蔚生物将重点介绍抗体的非放射性标记及其用途。

图1.直接夹心 ELISA，使用捕获抗体和一抗

  生物素

  生物素是一种小分子（244.3Da），可与其结合伙伴亲和素（存在于蛋清中）和链霉亲和素（由细菌链霉菌产生）形成自然界中发现的最强的非共价相互作用之一。由于其大小，生物素很少会干扰抗体的活性，因此使其成为标记的良好选择。

  生物素标记抗体用于Westerns、ELISA、流式细胞术、免疫荧光和免疫组织化学，当抗原难以检测时，通常使用生物素标记抗体来提高检测的灵敏度。通常，印迹或样品与生物素标记抗体一起孵育，然后再与用酶或荧光染料标记的亲和素或链霉亲和素一起孵育。抗体通常与多个生物素分子（3-6个分子）结合，从而产生扩增步骤，增强对较少抗原的检测。虽然生物素标签可以改善检测，但它可能难以用于蛋白质的分离/纯化，因为生物素和（链霉）亲和素之间的强相互作用很难破坏。

  许多公司出售含有活性生物素分子的生物素化试剂盒，可轻松标记蛋白质。通常，抗体通过使用生物素类似物的N-羟基琥珀酰亚胺酯标记在赖氨酸的ε-氨基上。生物素使用至少6个原子的间隔臂附着在蛋白质上，以防止下游操作过程中的空间位阻。间隔臂的长度和组成可以变化，以优化测定。

  酶报告基因

  传统上，Western、ELISA和IHC中最常用的抗体标记是酶报告标记。酶标记比生物素大，但它们很少干扰抗体功能。最常用的酶标记是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。

  要使用酶标记抗体，需要将样品与酶特异性底物一起孵育，酶催化该底物产生有色产物（显色测定）或光（化学发光测定）。每种酶都有一组可用的底物和检测方法。例如，HRP可以与二氨基联苯胺反应产生棕色产物，或与鲁米诺反应产生光。相反，AP可以与对硝基苯基磷酸盐(pNPP)反应产生黄色产物（分光光度计可检测到），或与5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)和硝基蓝四唑(NBT)反应产生紫色沉淀。显色测定适用于蛋白质印迹、ELISA和IHC，而发光反应最常用于蛋白质印迹。许多具有不同灵敏度和输出的底物可用于检测，这使得酶报告基因成为最受欢迎的抗体标记之一。

  虽然报告酶也与赖氨酸的ε-氨基结合，但由于酶含有赖氨酸并具有多聚化的潜力，因此可以使用其他化学方法。酶标记的二抗在多家公司广泛供应，而其他公司则销售用于在实验室中标记抗体的试剂盒。

  荧光标签

  实验室中荧光标记抗体的使用正在稳步增加。由于荧光染料直接与抗体结合，因此检测不需要酶/底物或结合相互作用。因此，检测到的荧光信号量与样品中的目标蛋白量成正比。荧光标记用于荧光蛋白质印迹分析、流式细胞术和IF，可用于高度定量分析。

  要检测荧光标记，需要一种仪器，该仪器发射特定波长的光来激发荧光染料。然后，荧光染料会发出不同波长的信号。同一仪器包含适当的滤光片，用于检测荧光染料的发射。流式细胞术需要使用流式细胞仪，而IF则使用荧光显微镜。Western印迹通常采用数字成像系统。抗体可以用各种具有不同激发和发射光谱的荧光染料进行标记。除了高度定量外，荧光标记还具有独特的优势，即能够通过使用具有不重叠发射光谱的染料来同时多路复用或检测两种或多种不同的目标蛋白。

对于标记，荧光标签可以通过一级胺或硫醇基团共价连接到抗体上。荧光标记抗体可从许多公司购买，或者可以使用商业试剂盒在实验室中标记抗体。